ЭМБРИОЛОГИЯ
Биология развития (эмбриология) - наука о закономерностях онтогенеза многоклеточных
организмов, начиная с гаметогенеза и включая послезародышевое развитие. Биология развития изучает строение и функции зародышей на последовательных стадиях развития вплоть до становления взрослых форм и последующего старения организма. Развитие находится под контролем генетических факторов и факторов окружающей среды, оно регулируется на уровне целого организма, зачатков органов и тканей, на клеточном, субклеточном, а также молекулярном уровнях.
Биология развития опирается на достижения смежных наук - цитологии, генетики, молекулярной биологии, эволюционной теории и экологии. Поэтому изложение курса "Эмбриология" дополняется необходимыми сведениями из перечисленных выше дисциплин.
Предмет и история эмбриологии
Предмет эмбриологии, ее связь с другими биологическими дисциплинами. Краткий обзор истории эмбриологии. Воззрения Гиппократа и Аристотеля. Эмбриология XVII-XVIII вв.
Преформисты и эпигенетики. Работы К.Ф.Вольфа. Развитие эмбриологии в XIX веке. Значение работ К. Бэра. Влияние дарвинизма на эмбриологию. Сравнительно-эволюционное направление (А.О. Ковалевский, Э. Геккель, И.И. Мечников). Исторические корни экспериментальной эмбриологии, ее современные задачи. Каузально-аналитический метод, его сильные и слабые стороны. Дискуссия неопреформистов и неоэпигенетиков (В. Гис, В. Ру, Г.Дриш). Основные направления и задачи современной описательной, экспериментальной, сравнительной и теоретической эмбриологии. Ее связь с цитологией, генетикой и молекулярной биологией.
Прикладное значение эмбриологии.
Эмбриология - наука, изучающая индивидуальное развитие многоклеточного организма, а также закономерности изменений его морфофункционального состояния на протяжении всего онтогенеза.
Она включает в себя определенные разделы цитологии, гистологии, генетики и молекулярной биологии. Одним из начал эмбриологии, по-видимому, была акушерская практика (как одна из первых форм медицинской помощи). Второе начало – мировоззренческое (эмпирическое – движение от факта к факту и теоретическое – общее представление о появлении жизни, зарождении, развитии организма).
Первые теории, послужившие в дальнейшем основой для развития науки, появились во времена античности.
Эмпедокл (444 до н.э.) утверждал, что человек формируется с 31 дня по 50. Он полагал, что кости есть земля и вода, сухожилия – земля и воздух и т.п. Также считал, что рождение близнецов или уродов есть результат работы воображения матери. Считал, что зародыш начинает дышать с момента рождения.
Диоген утверждал, что плацента – орган питания зародыша. И высказал идею о последовательном развитии структур.
Гиппократ – первые регулярные знания в области эмбриологии. (460-370 гг. до н.э.) В основном связаны с акушерством и гинекологией. Труды «О диете», «О семени», «О природе ребенка». Он говорит о трёх неотъемлемых свойствах каждого тела – сухость, влажность, тепло. Они никогда не встречаются раздельно. Все процессы в организме Гиппократ сравнивает с процессами в неорганических телах и с трудовой деятельностью.
Он высказал идею о преформации: «Все части зародыша образуются в одно и то же время. Все члены отделяются друг от друга одновременно и таким же образом растут. Ни один не возникает раньше или позже другого, но те, которые по природе своей толще появляются прежде тонких, не будучи сформированы раньше» (Преформизм – всё определено изначально)
Аристотель (384-322 гг. до н.э.) Положил начало общей и сравнительной эмбриологии. Труд «О возникновении животных». Он вскрывал куриные яйца, анатомировал и изучал всевозможных зародышей хладнокровных животных и млекопитающих и даже, возможно, абортивных зародышей человека. (Эпигенез - всё возникает заново)
Аристотель:
1) Предложил классификацию животных по эмбриологическим признакам.
2) Ввел сравнительный метод изучения и заложил представления о различных путях эмбрионального развития; ему было известно яйцерождение и живорождение.
3) Установил различия между первичными и вторичными половыми признаками.
4) Отнес определение пола к ранним стадиям эмбрионального развития.
5) Выдвинул концепцию неоплодотворенного яйца как сложной машины, части которой придут в движение и станут выполнять свои функции, как только будет поднят главный рычаг.
6) Правильно истолковал функции плаценты и пуповины.
7) Связал явление регенерации с явлением эмбриогенеза.
8) Предвосхитил теорию рекапитуляции своим суждением о том, что в процессе эмбрионального развития общие признаки появляются раньше частных.
9) Предложил теорию градиентов формообразования своими наблюдениями о более быстром развитии головного конца зародыша.
10)Установил, что существующие предположения сводятся к антитезе преформация – эпигенез. Сам он настаивал на правильности второго варианта – эпигенеза.
Он также высказал идею 4х причин – материальной, действующей, формальной и финальной. В средние века превалировала четвертая, финальная причина, в силу её связи с идеей божественного начала.
Лишь Френсис Бэкон (1561-1626) доказал. Что с научной точки зрения конечная причина – ненужная концепция. До этого момента со смерти Аристотеля в эмбриологии ничего не менялось.
В 17 веке Антони Ван Левенгук изобрёл микроскоп. Описывал проникновение в матку и трубы сперматозоидов у различных живых организмов.
Полемика между К. Вольфом (Питерская академия наук) и А. Галлером.
Галлер стоял на стороне преформизма, а Вольф показал на примере развития кровеносной, а позже и пищеварительной систем, что сначала системы эти выглядят как листки, затем как желобки, и в конце концов превращаются в трубки. В 1776 составил труд «О формировании кишечника». Авторитет Галлера воспрепятствовал признанию правоты Вольфа, но, со временем, она была признана.
Работы эмбриологов 19 века К. Бэра и Х.Г. Пандера строились именно на признании правоты Вольфа.
К. Бэр. Один из крупнейших естествоиспытателей своего времени. Он развил учение Пндера о зародышевых листках, выделил анимальный (дающий покровы и НС) и вегетативный (дающий сосуды, мышцы, пищеварит. тракт) полюса, зародышевую хорду.
Он сделал выдающееся обобщение, определившее эмбриологию как самомстоятельную науку – сходство в развитии эмбрионов высших и низших животных. Закономерность заключалась в том, что сначала развиваются признаки, характерные для типа, затем класса и т.д.) – Закон Бэра. Он заметил, что онтогенез есть преформированный эпигенез. (Возникает заново, но в предопределенной форме)
Бишоф дал названия зародышевым листкам, сохранившиеся и сегодня (мезо-, энто- и эктодерма) Поставив в основу учение Т.Шванна о клетке. Он показал, что одноименные листки разных животных сходны по гистологическому строению.
Ч.Дарвин подогрел интерес к эмбриологии. Многие эволюционисты пытались использовать эмбриологические данные для подтверждения теории эволюции.
Эрнст Геккель сформулировал основной биогенетический закон «Развитие зародыша есть сжатое и сокращенное повторение эволюционного развития данной группы организмов. Оно тем полнее, чем более сохраняется палингенез (палингенез – признак или процесс в эмбриогенезе, повторяющий соответствующий признак или процесс филогенеза данного вида)
Вейсман (1834-1914) использовал цитогенетический подход, в то время как до этого пользовались лишь сравнительно эволюционным и описательным. Он предложил концепцию о неравномерном делении, о выделении зародышевого пути и о неравно наследственном митозе. Основана на опытах Бовери с аскаридами. Он описывал явление деминуции хроматина (потеря части хромосом в соматических клетках).
Опыты Ру с прижиганием половины 4х клеточного зародыша. (Из половины развивалась только пол орг-ма) Однако при изоляции половинок развивались полноценные орг-мы. Опыты Ганса Дриша с гребневиками (и прижигание, и изоляция давали уменьшение числа гребней.) Также выяснилось, что дефект, нанесенный цитоплазме незрелого яйца исправляется, а зрелого – ведет к нарушениям у зародыша. Выяснилось, что при удалении бластомеров у кольчатых червей, моллюсков развивается личинка с невосполнимыми дефектами, а у иглокожих, кишечнополостных, асцидий – нормальный зародыш. Это как бы сочетания преформизма у первых и эпигенеза у вторых.
Казуально - аналитический метод пришел на смену описательному и сравнительному. Стала формироваться экспериментальная и аналитическая эмбриология.
Сильные стороны – возможность получать принципиально новую информацию, данные.
Слабые стороны – (что будет если.. Метод основан на эксперименте, теория подгоняется под результат эксперимента. Этот метод не даёт возможности понять механизм, мы видим лишь результат действия.)
Дриш относился к неоэпигенетикам, Ру к неопреформистам.
Именно Дришу удалось установить эквипотенциальность ядер бластомеров некоторых развивающихся яиц. Он установил, что отличаются они цитоплазмой. В то же время яйца морских ежей давали абсолютно идентичные бластомеры. Дриш заключил, чот судьба бластомеров есть функция их положения в целом. (предвосхищение современных убеждений о позиционной информации). Дриш также сделала вывод, чот проспективная потенция бластомера всегда шире его проспективного значения (может развиться больше всего разного, чем получается при нормальном развитии).
Сегодня эмбриология во многом сопряжена с генетикой, молекулярной биологией и цитологией. Использование методов этих наук позволяет глубже вникать в существующие вопросы и устанавливать ранее недоступные детали. Сегодня эмбриология во многом перешла на микроуровень. Экспериментальная эмбриология в наше время во многом урезана в своих возможностях в связи с ограничениями, накладываемыми биоэтикой.
Гаметогенез
Формирование первичных половых клеток (гоноцитов) у различных групп животных (губки, кишечнополостные, круглые черви, ракообразные, позвоночные).
Гоноцит, или первичная половая клетка - это эмбриональная клетка, из которой впоследствии могут образовываться половые клетки.
У всех животных, имеющих морфологически выраженные гонады, половые клетки закладываются независимо от половой железы (экстрагонадно). С момента обособления и до вселения в гонаду эти клетки и называются гоноцитами.
У некоторых животных половые клетки способны образоваваться из соматических клеток на протяжении всего онтогенеза. К таким животным относятся губки, кишечнополостные и плоские черви. У губок половые клетки образуются из амебоцитов и хоаноцитов. У кишечнополостных половые клетки образуются из интерстициальных (I-) клеток, у плоских и кольчатых червей - из необластов.
Поэтому половые клетки у них могут возникать и в случае регенерации из небольших участков тела взрослых животных при полном удалении половых желез.
У продолжительно голодающих планарий половые клетки могут дедифференцироваться и превращаться в стволовые клетки, используемые для регенерации соматических тканей.
У кольчатых червей происходит раннее обособление зачатка половых клеток, которые образуются из соматических. Таким образом, у них существуют два источника гоноцитов: раннеэмбриональный и соматический.
Согласно современным представлениям, у остальных животных зачаток гоноцитов обособляется на стадии гаструлы или нейрулы. У большинства круглых червей, членистоногих и бесхвостых амфибий половые клетки обособляются уже в процессе дробления.
Так, у двукрылых насекомых еще до начала дробления в заднем полюсе яйцеклетки находятся базофильные гранулы, состоящие из РНК и белка. Впоследствии, половые клетки обособляются именно из этого участка цитоплазмы. У дрозофилы окончательное обособление половых клеток происходит на 13-м делении дробления.
В яйцеклетке веслоногого рака циклопа присутствуют аналогичные гранулы (эктосомы). В результате делений дробления эктосомы распределяются между двумя клетками, которые и дают начало половым. Обособление половых клеток происходит на 5-м делении дробления. Еще раньше (на 4-м делении дробления) половые клетки выделяются у ветвистоусых раков, а также у некоторых выдов круглых червей.
У лошадиной аскариды, в самом начале развития, при делении соматических клеток происходит диминуция хроматина (отторжение в цитоплазму и последующая деградация части хроматина). При образовании гоноцитов диминуции не происходит. Таким образом, половые клетки обособляются от соматических, сохраняя свою тотипотентность.
У рыб гоноциты обособляются в конце гаструляции. Их источником служит первичная энтомезодерма. Возможно, в гонадах взрослых рыб присутствуют первичные половые клетки.
В яйцеклетках амфибий еще в начале периода роста ооцита на вегетативном полюсе обнаруживаются РНК-содержащие структуры, которые следует отнести к половой цитоплазме (безжетлковая цитоплазма, "зародышевая (половая) плазма"). Гоноциты у бесхвостых амфибий выделяются на стадии бластулы, среди бластомеров будущей энтодермы. На стадии поздней гаструлы клетки, содержащие половую плазму, обнаруживаются во внутренней части энтодермы и в области желточной пробки. На стадии хвостовой почки эти клетки располагаются в области дорсальной энтодермы. У молодых личинок они еще некоторое время остаются в составе энтодермы, прежде чем попадут в гонаду.
Формирование гоноцитов у хвостатых амфибий, в отличие от бесхвостых, происходит не автономно, а под влиянием соседних эмбриональных тканей. Гоноциты возникают на стадии гаструлы или нейрулы. Они обособляются из мезодермы под воздействием энтодермы (такое воздействие осуществляется еще на стадии бластулы).
У рептилий первичные половые клетки обнаруживаются во внезародышевой энтодерме.
У птиц первичные половые клетки возникают рядом с задним концом зародыша. Затем они перемещаются вперед, в область головного серпа, все время находясь во внезародышевой области. Когда возникает внезародышевая система кровообращения, гоноциты с током крови перемещаются внутрь тела зародыша.
Половые клетки млекопитающих являются потомками эмбриональных тотипотентных клеток, присутствующих в бластодерме зародыша в период формирования первичной полоски. Затем они попадают в заднюю внезародышевую энтодерму, мигрируют в стенку кишки и в окружающую ее мезенхиму. Далее они перемещаются в дорзальный мезентерий к закладке гонады.
Итак, единственный источник половых клеток у позвоночных, членистоногих и круглых червей - это первичные гоноциты, которые обособляются на ранних стадиях развития. Однако далеко не у всех групп животных гоноциты не могут пополняться за счет соматических клеток на более поздних стадиях развития. У губок, кишечнополостных, некоторых кольчатых червей и полухордовых имеются тотипотентные стволовые клетки, которые в течение всей жизни пополняют запас половых клеток.
Возникновение половых клеток в процессе эволюции - это первая дифференцировка клеток организма. При этом половые клетки сохраняют свою тотипотентность. Такое разделение было важнейшим эволюционным событием, которое позволило перейти от одноклеточности к многоклеточности.
Миграции гоноцитов в гонаду.
Прежде всего гоноциты должны добраться до закладки гонады. Как первичные гоноциты, так и резервные клетки, типа интерстициальных способны двигаться самостоятельно, но значительную часть пусти они проходят пассивно, с током крови. Поблизости от зачатка половой железы гоноциты движутся активно.
На стадии первичных гоноцитов мужские и женские половые клетки, как правило, неотличимы. Различия появляются лишь после их проникновения в половые железы. При этом женские гоноциты заселяют кортикальную часть гонады, а мужские гоноциты - медуллярную.
Половые клетки, попавшие в зачатки гонаду и приступившие к размножению, называются гониями (сперматогонии и оогонии).
У многих животных существуют особые стволовые клетки, продуцирующие гонии в течение долгого периода времени (или даже всей жизни). Известны два типа стволовых клеток. Одни из них делятся ассиметрично, вследствие чего одна из дочерних клеток остается стволовой, а другая вступает на путь дальнейшего развития. Так, например, происходит у дрозофилы.
В других случаях (например, у круглых червей) стволовые половые клетки делятся симметрично, и судьба каждой из них определяется тем, какое положение они случайно займут в гонаде.
Оогенез, его основные периоды: размножение, рост, созревание яйцеклеток.Типы питания яйцеклеток: фагоцитарный, нутриментарный, фолликулярный. Связь яйцеклетки с питательными клетками при разных типах питания; поступающие в яйцеклетку вещества. Превителлогенез и вителлогенез. Профаза мейоза, протекающие в ней цитологические и биохимические перестройки. Амплификация генов. Синтез рРНК и мРНК. Поляризация яйцеклетки. Особенности делений созревания яйцеклетки.
Как уже было сказано, попав в гонаду, гоноциты приступают к размножению путем обычных митотических делений. На этой стадии женские половые клетки называются оогониями . Оогонии прекращают размножаться еще в эмбриональном периоде, задолго до наступления половозрелости самки. У пятимесечного плода человека имеется 6-7млн. женских половых клеток. Потом наступает их массовая гибель путем апоптоза. В результате, к моменту рождения остается около 1 млн. клеток, а к моменту половой зрелости - менее 400 000 клеток. К 50 годам у женщины остается всего около 1 000 половых клеток.
Женская половая клетка, прекратившая размножение, называется ооцит I порядка . Начинается своеобразный, свойственный только этой клетке, период роста. Он связан с поступлением в яйцеклетку питательных веществ извне и с рядом синтетических процессов в самой яйцеклетке. Увеличение яйцеклетки в период роста может быть колоссальным. Так ооциты дрозофилы за 3 дня увеличиваются в 90 000 раз. У млекопитающих ооциты увеличиваются в объеме более чем в 40 раз. Рост яйцеклетки млекопитающего может длиться десятки лет. Например у человека - до 30 лет.
Рост ооцитов принято разделять на два периода. Период малого роста (превителлогенез или цитоплазматический рост) и большого роста (вителлогенез, трофоплазматический рост).
Для периода малого роста характерно относительно малое и пропорциональное увеличение ядра и цитоплазмы, при котором ядерно-цитоплазматическое отношение не изменяется. Весь период превителлогенеза проходит на фоне подготовки клетки к последующим делениям созревания. На этой стадии ооцит I порядка вступает в S-фазу, то есть в фазу удвоения ДНК. После этого наступает профаза 1-го деления мейоза. На этой стадии происходят коньюгация хромосом, образование синаптонемального комплекса, кроссинговер. В ядре ооцита последовательно проходят этапы лептотены, зиготены, пахитены и диплотены. На стадии диакинеза наступает стационарная фаза, при этом дальнейшее течение мейоза сильно замедляется или прекращается полностью. Этот блок мейоза продолжается до достижения особью половозрелости. Однако на этой стадии ДНК ооцита является активной. Она выполняет роль матрицы для синтеза всех видов РНК. Эти молекулы РНК, в основном, синтезируются для использования их яйцеклеткой уже после оплодотворения.
Синтез рРНК связан (28S и 18S) с явлением амплификации генов, кодирующих данные виды РНК. Амплифицированные участи обособляются в виде ядрышек, которых может быть несколько тысяч. Амплификация идет, в основном, на стадии пахитены. После созревания ооцита ядрышки входят в цитоплазму клетки и там лизируются.
Синтез 5S-рРНК и тРНК происходит без амплификации, за счет того, что кодирующие их гены многократно повторены.
Синтез мРНК связан с приобретением хромосомами ооцита структуры "ламповых щеток". При этом период "ламповых щеток" наблюдается у ооцитов с солитарным и фолликулярным типами питания. В других случаях этот период сокращен или отсутсвтует. Молекулы мРНК, запасенные для развития оплодотворенной яйцеклетки, присутствуют в цитоплазме ооцита в виде информосом - комплекса мРНК с белками.
Период большого роста характеризуется сильным ростом цитоплазматических компонентов. Ядерно-цитоплазматическое отношение при этом уменьшается. В течение данного периода в ооците I порядка откладывается желток (лат. вителлус) в виде гранул, а также другие питательные вещества: жиры и гликоген.
По количеству откладываемого желтка яйцеклетки делят на:
ñ полилецитальные (многожелтковые), встречаются у большинства членистоногих, рыб и птиц;
ñ мезолецитальные (со средним количеством желтка), встречаются у амфибий и осетровых;
ñ олиголецитальные (маложелтковые), встречаются у большинства червей, у моллюсков и иглокожих;
ñ алицетальные (безжелтковые), встречаются у млекопитающих и некоторых форм беспозвоночных.
Количество жедтка в клетке строго определено генетически и почти не зависит от условий питания самки.
По характеру расположения желтка яйцеклетки классифицируют на:
ñ изолецитальные (олиго- и мезолецитальные)
ñ телолецитальные (полилецитальные - костистые рыбы, мезолецитальные - амфибии)
ñ центролецитальные (полилецитальные - насекомые)
По способу образования желток делят на:
ñ экзогенный желток, строится на основе белка-предшественника - вителлогенина, поступающего в ооцит извне (у позвоночных он синтезируется в печени матери и находится под гормональным контролем: гипоталамус выделяет гормон люлиберин, под влиянием которого гипофиз выделяет ФСГ и ЛГ в кровь, в ответ на это клетки фолликула синтезируют эстроген, который регулирует синтез вителлогенина клетками печени как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции) . Желточные гранулы формируются уже внитри самого ооцита. При формировании гранул желтка вителлогенин расщепляется на сильно фосфорилированный белок фосвитин, содержащий 8% фосфата, и белок липовителлин, содержащий до 20% липидов. Структурная единица желточной пластины образована одной молекулой липовителлина и двумя молекулами фосфитина.
ñ эндогенный желток, который синтезируется из низкомолекулярных предшественников внутри самого ооцита. Лишь немногие типы яйцеклеток развиваются исключительно за счет эндогенного желтка.
В ходе эволюции наблюдается переход от факультатиыной гипертрофии клетки-родоночальника будущего организма - к обязательной гипертрофии.
Выделяют следующие способы питания яйцеклеток:
ñ диффузный (фагоцитарный) описан у губок и пресноводной гидры. Растущий ооцит поглощает более мелкие клетки путем фагоцитоза. Некоторое время ядро фагоцитированных клеток может сохранять синтетическую активность, снабжая ооцит копиями мРНК. Затем поглощенные клетки гибнут путем апоптоза. Основной биохимический процесс в цитоплазме такого ооцита - синтез гидролитических ферментов для переваривания фагоцитированного материала, который откладывается в фаголизосомах. При таком типе питания не образуется настоящих желтковых гранул.
ñ солитарный (одиночный) типа питания встречается в том случае, когда ооцит не связан непосредственно с какими-либо другими клетками и получает все необходимые вещества из окружающей среды в низкомолекулярной форме. Данный тип питания встречается у колониальных гидроидных полипов, морских звезд, ланцетника и других видов. В данном случае, желток и все типы РНК синтезируются самим ооцитом, то есть, желток является эндогенным.
ñ алиментарный , то есть, осуществляемый с помощью вспомогательных клеток. Подразделяется на:
u нутриментарный тип питания появляется в различных группах червей и достигает наивысшего развития у членистоногих. В данном случае ооцит окружен специальными питающими клетками - трофоцитами, связанными с ооцитом цитоплазматическими мостиками. Трофоциты и ооциты возникают от одного и того же гнезда размножающихся оогониев. Судьба оогониальных клеток определяется количеством связей (цитоплазматических мостиков) с другими клетками. Основная функция трофоцитов - синтез рРНК, поступающей в ооцит. К синтезу желтка трофоциты отношения не имеют. Основная часть желточных белков при нутриментарном способе питания синтезируется в соматических клетках и поступает в ооцит посредством пиноцитоза.
u фолликулярный тип питания является наиболее распространенным и совершенным и встречается у ряда беспозвоночных и большинства хордовых. Особенного развития он достигает у млекопитающих. Данный тип питания связан с образованием из соматических клеток гонады одного или нескольких слоев фолликулярного эпителия, окружающего ооцит. Ооцит вместе с фолликулярным эпителием, который отделен от ооцита периооцитным пространством, называется фолликулом. Фолликулярный тип питания может сочетаться с нутримернатным (например, у насекомых). Универсальной функцией фолликулярного эпителия является роль избирательно проницаемого барьера для белков, поступающих из кровеносных сосудов в периооцитное пространство. Благодаря этой функции вокруг оофита создается повышенная концентрация вителлогенинов, поглощаемых ооцитом путем пиноцитоза. Также, на поздних стадиях оогенеза, фолликулярные клетки могут выделять белки, идущие на построение вторичной оболочки яйцеклетки. Кроме этих функций, фолликулярные клетки могут выполнять и специфические функции: синтез рРНК (рептилии и птицы), синтез желточных белков (головоногие моллюски), синтез андрогенов и эстрогенов, находящийся под контролем гонадотропных гормонов гипофиза (позвоночные).
Фолликулярные клетки образуются из коркового слоя яичника и окружают ооцит. Образовавшиеся сферические структуры, содержащие плоские фолликулярные клетки, называются примордиальными фолликулами . Далее фолликулярные клетки становятся квадратными, и фолликул называется первичным однослойным . Однослойные фолликулы, в результате размножения фолликулярных клеток становятся многослойными. Затем фолликулярные клетки начинают выделять жидкость и постепенно резорбироваться. На их месте возникают полости (вторичный фолликул ), сливающиеся в конце концов в одну. В результате образуется зрелый третичный фолликул или Граафов пузырек . Затем стенка Граафова пузырька лопается, яйцеклетка освобождается и выходит из яичника в яйцевод, окруженная слоем фолликулярных клеток (лучистый венец - corona radiata). Данный процесс называется овуляцией . После овуляции ооцит приступает к делениям созревания.
Созревание ооцита - это процесс последовательного прохождения двух делений мейоза (делений созревания). Выход из фазы диакинеза и начало собственно делений созревания приурочены к достижению самкой половозрелости и определяются половыми гормонами: гонадотропные гормоны гипофиза воздействют на фолликулярный эпителий, который в ответ выделяет прогестерон и его аналоги. Гормоны фолликулярного эпителия поступают в ооцит и стимулируют его созревание.
Из двух делений созревания первое является редукционным, при этом каждая из образовавшихся клеток приобретает половинный набор хромосом. Поскольку 1-му делению созревания предшествовала S-фаза, каждая из разошедшихся хромосом состоит из двух идентичных хроматид. Эти хроматиды и расходятся по сестринским клеткам во втором делении созревания, которое является эквационным.
Основная особенности делений созревания в ооцитах состоит в том, что эти деления резко неравномерны. Перед первым делением созревания ядро ооцита мигрирует к его поверхности. Та точка поверхности ооцита, к которой ближе всего располагается ядро, названа анимальным полюсом. Противоположная точка - вегетативный полюс. В результате первого деления созревания половина хромосомного набора выталкивается в очень маленькую клетку, которая называется первым редукционным или полярным тельцем .
Яйцевая клетка после выделения I редукционного тельца называется ооцитом II порядка . Второе деление созревания осуществляется путем выделения II редукционного тельца таких же размеров, как и I. После его выделения ооцит II порядка превращается в зрелое яйцо.
Лишь у некоторых видов (некоторые кишечнополостные, морские ежи) мейоз доходит до конца бещ участия сперматозоида, внедряющегося в яйцеклетку. У большинства животных течение мейоза останавливается на некотором этапе созревания. Возникает блок мейоза , и для дальнейшего его протекания требуется активация яйцеклетки.
Различают три типа блока мейоза:
1. Мейоз останавливается на стадии диакинеза профазы 1-го деления, т.е. участие сперматозоида необходимо для протекания обоих мейотических делений. Этот тип мейоза наблюдается у губок, некоторых представителей плоских, круглых и кольчатых червей, моллюсков. Сюда же относятся собака, лиса и лошадь.
2. Мейоз останавливается на метафазе 1-го деления созревания. Такой блок отмечен у некоторых губок, немертин, кольчатых червей, моллюсков и почти у всех насекомых.
3. Мейоз останавливается на метафазе 2-го деления созревания. Сюда относятся почти все хордовые. У летучих мышей блок мейоза происходит на анафазе 2-го деления созревания. Именно на этих стадиях происходит овуляция яйцеклетки.
Как уже говорилось, у яйцеклетки выделяются анимальный и вегетативный полюса. Эта анимально-вегетативная поляризация решающим образом ориентирует последующие морфогенетические процессы: за редкими исключениями первые две борозды делений дробления проходят по взаимно перпендикулярным анимально-вегетативным мередианам, пересекаясь на анимальном и вегетативном полюсах. У взрослых животных передне-задняя ось тела либо совпадает с анимально-вегетативной осью яйцеклетки (позвоночные), либо перпендикулярна ей (членистоногие).
Первые морфологические проявления поляризации яйцеклетки приурочены к периоду вителлогенеза: у большинства яйцеклеток желток откладывается приемущественно в вегетативном полушарии, а ядро оттесняется в анимальное полушарие. Но только во время второго деления созревания поляризация становится устойчивой и необратимой.
Материальные носители полярности яйцеклетки до сих пор полностью не выявлены, но судя по всему, они локализованы в плазматической мембране, а не в цитоплазме яйцеклетки. В последнее время были получены данные о наличии электрических полей, ориентированных от одного полюса яйцеклетки - к другому. Такие поля связаны с неравномерным распределением ионных каналов по мембране. Утверждается, что расположение насосов и ионных каналов однозначно определяет полярность яйцеклетки.
Кроме плазматической мембраны яйцо может быть окружено еще несколькими оболочками. Различают следующие оболочки:
ñ Первичные (желтковые), представляющие собой производные мембраны яйцеклетки. Они присущи яйцеклеткам почти всех животных (кроме губок и большинства стрекающих), но особенно хорошо развиты у позвоночных. Первичная оболочка млекопитающих называется блестящей оболочкой (zona pellucida). Первичная оболочка образована гликопротеинами, обеспечивает видовую специфичность адгезии спермия при оплодотворении. Возможно, внешняя часть данной оболочки образована выделениями фолликулярных клеток.
ñ Вторичные оболочки (хорион) образуются как продукт выделения фолликулярных клеток. Лучше всего выражены у насекомых. В хорионе имеется одно или несколько отверстий (микропиле), через которое сперматозоид проникает в ядро.
ñ Третичные оболочки выделяются железами яйцевода. Очень сильно они развиты у химеровых рыб, амфибий, рептилий и птиц. У птиц третичные оболочки представлены белком, двумя слоями подскорлуповой пергаментной оболочки и скорлупой.
При прохождении яйца по яйцеводу оно вращается. Интересно, что передне-задняя ось зародыша расположена всегда перпендикулярно направлению движения яйца по яйцеводу, а направление от хвоста зародыша к голове совпадает с направлением вращения яйца.
Характерные особенности сперматогенеза. Спермиогенез.
Мужские половые клетки, как и женские, возникают из первичных гоноцитов. При сперматогенезе непосредственными потомками гоноцитов являются стволовые сперматогенные клетки (у млекопитающих их называют сперматогониями типа А ). Они присутствуют не только у зародышей, но и у половозрелых самцов. В семенниках млекопитающих они располагаются в пристеночном слое семенных канальцев. Стволовые клетки нерегулярно делятся. Некоторые из них перемещаются ближе к центру канальца, их деления становятся более регулярными (сперматогониальные деления), а после каждого деления изменяется форма и величина клеток. Такие клетки называют сперматогониями (сперматогониями типа В ).
Сперматогониальные деления происходят постоянно у половозрелых самцов. Число делений сперматогония определено для каждого вида (4 для человека).
После определенного числа делений сперматогоний передвигается еще ближе к просвету канальца и вступает в профазу 1-го деления созревания. На этой стадии он называется сперматоцитом I порядка .
В результате первого деления созревания сперматоцит I порядка делится на два одинаковых сперматоцита II порядка , которые делятся на двесперматиды , в результате второго деления созревания.
Далее каждая сперматида преобразуется в сперматозоид . Этот сложный цитологический процесс, не сопровождающийся клеточными делениями, называется спермиогенезом . Процесс спермиогенеза продолжается несколько дней (у человека - 23 дня).
Как сперматогонии, так и сперматоциты и сперматиды всех исследованных видов животных связаны между собой цитоплазматическими мостиками, образуя синцитии. Этим объясняется высокая степерь синхронности делений сперматогониев и сперматоцитов. Между сперматидами по таким мостикам могут проходить мРНК.
Важное значение для сперматогенеза имеют соматические клетки, расположенные в стенках семенных канальцев - клетки Сертоли. Клетки Сертоли снабжают сперматогониальные клетки питательными веществами и гормонами, способствуют высвобождению сперматозоидов в просвет канальцев, фагоцитируют неполноценные сперматозоиды.
Клетки Сертоли не контактируют друг с другом на уровне базальной мембраны. Их контакт находится выше, над слоем сперматогоний. У плода и новорожденных между клетками Сертоли имеются лишь щелевые контакты. На протяжении пропубертатного периода происходит образование плотных контактов.
Как уже было сказано, после прохождения делений созревания образуется сперматида, которая является идентичной сперматозоиду генетически, но не цитологически. Основные процессы, происходящие во время спермиогенеза:
ñ ядро сперматиды сильно уплотняется, хроматин конденсируется и становится синтетически неактивным.
ñ происходят перемещения органелл: аппарат Гольджи смещается на апикальный конец сперматозоида (вперед от ядра) и формирует акросому, содержащую ферменты - спермолизины; центриоли смещаются на противоположный полюс ядра.
ñ из дистальной центриоли начинает расти жгутик. Вокруг основания жгутика располагаются спиралевидные митохондрии. Однако, у некоторых видов животных сперматозоиды лишены жгутика (круглые черви, ракообразные).
ñ почти вся цитоплазма отторгается.
Оплодотворение
Оплодотворение – вызываемое сперматозоидом побуждение яйца к развитию с одновременноц передачей яйцеклетке наследственного материала отца.
Дистантные взаимодействия гамет.
Дистантные взаимодействия – взаимодействия гамет при осеменении, осуществляющиеся до соприкосновения гамет. К ним относятся хемотаксис, стереотаксис и реотаксис.
Реотаксис – способность сперматозоидом передвигаться против тока жидкости в половых путях самки. Стереотаксис – способность двигаться по направлению к более крупному. чем сам сперматозоид, объекту – яйцеклетке.
К дистантным взаимодействиям можно также отнести реакцию капацитации сперматозоида, происходящую в половых путях самки. (1. Альбумины в половых путях самки связывают холестерин из мембраны сперматозоида, в результате чего уменьшается соотношение холестерин: фосфолипиды. Это приводит к дестабилизации акросомного пузырька. 2. Освобождение активных центров галактозилтрансфераз, ферментов, узнающих N-ацетилглюкозаминовые остатки в молекуле гликопротеина, расположенного на поверхности прозрачной оболочки яйцеклетки и представляющего, по сути, рецептор сперматозоида).
Многочисленные эксперименты свидетельствуют, что некоторая компонента ССИ не побочный продукт метаболизма, но может играть функциональную роль и является основой некоторых нехимических взаимодействий биосистем. Об этом свидетельствовали еще известные опыты А.Г. Гурвича с корешками лука [Гурвич, 1945] и другие его работы по митогенетическому излучению.
Феномен дистантных, т.е. без непосредственного контакта и неопосредованных химически, межклеточных взаимодействий (ДМВ) был строго установлен и исследован В.П. Казначеевым с сотрудниками в опытах с «зеркальным» цитопатическим эффектом [Казначеев и др., 1979, 1980; Казначеев и Михайлова, 1981, 1985]. Находящиеся под воздействием экстремальных факторов физической, химической или биологической природы клетки вызывали в клеточной культуре- реципиенте (помещенной в соседнюю с первой изолированную камеру и не подвергаемой воздействию этих факторов) морфологические изменения, аналогичные изменениям в первой клеточной культуре- индукторе (с достоверным значением вероятности 70-78 %). Взаимодействие клеточных культур осуществлялось только посредством сверхслабого электромагнитного излучения самих клеток через кварцевую (или слюдяную) пластинку, прозрачную в ультрафиолетовом и инфракрасном диапазонах. В этих опытах впервые удалось полностью исключить химическую компоненту ДМВ. ДМВ были исследованы также в модели, позволяющей рассмотреть роль электромагнитного излучения в жизненном цикле клетки в отличие от модели экстремального воздействия на клеточную систему. По мере разнесения культур или при утолщении кварцевых и слюдяных подложек эффективность связи падает, что означает, что эффективность проявления зеркального цитопатического эффекта зависит от поглощения и рассеивания электромагнитных волн - носителей информации. Отметим следующие свойства зеркального эффекта [Там же]: 1. Зеркальный цитопатический эффект максимально проявляется в парах из гомологичных клеточных культур, слабее - в близкородственных клетках, в гетерогенных, генетически далеко отстоящих друг от друга зеркального цитопатического эффекта нет. 2. Здоровые клетки, воспринявшие информацию пораженных клеточных культур, будучи в контакте со следующей новой здоровой культурой, способны передавать ее дальше; зеркальный эффект обладает способностью пассироваться с постепенным угасанием до 3-4 пассажа. 3. Проявление эффекта зависит от географической широты, солнечной активности и геомагнитной обстановки.
Один из возможных общих подходов к постановке и исследованию вопросов данного рода выдвинут В.П. Казначеевым. Согласно концепции В.П. Казначеева [Там же], биосистема (клетка) может быть представлена как неравновесная фотонная констелляция, существующая за счет притока энергии извне. Чисто химический механизм межклеточной и внутриклеточной связи может быть не первичным, а следствием более сложных процессов. Функционирующая клетка является источником и носителем сложного электромагнитного поля, структура которого порождается биохимическими процессами, и управляет всей метаболической деятельностью клетки. (Мембраны можно рассматривать как основную структуру - носитель неравновесной фотонной констелляции.) Фотонные констелляции могут рассматриваться как первичный субстрат самой жизни, не как проявление вторичного способа передачи биологической информации. Данная констелляция имеет высокую степень надежности и является информационно- регулирующей системой клетки. Предположительно в макромоле- кулярной белково-нуклеиновой форме живого вещества (клеток) присутствуют другие - квантово-полевые - формы живого вещества, обладающие способностью перемещаться в оптической среде в другие непораженные макромолекулярные белково-нуклеиновые организации, изменять их состояние и вновь перемещаться, при этом из одной клеточной культуры в другую осуществляется поток предполагаемой формы живого вещества. Таким образом, суть живого вещества полевая. Это значит, что материальный поток в существующей электромагнитной земной среде в своем движении, попадая в заселенное атомами и молекулами пространство, при соответствующих физико-химических условиях строит из них вторичную сложную макромолекулярную структуру. Эти структуры могут мигрировать при соответствующих условиях из одной мак- ромолекулярной структуры (клетки, живые организмы) в другую, взаимодействовать друг с другом, изменять вторичные биохимические свойства.
Заметим, что эту концепцию подтверждают результаты экспериментов Л. Монтенье (пп. 2.2).
Дистантные взаимодействия, опосредуемые ССИ в диапазоне от ультрафиолетового до ближнего инфракрасного, воздействуют на активность энзимов [Баскаков и Воейков, 1996], активность и морфологию клеток и тканей [Казначеев и Михайлова, 1985], жизненный цикл клетки [Там же], регулируют локомоцию и взаимную ориентацию клеток , определяют скорость развития эмбрионов и их морфологические черты [Бурлаков и др., 1999а, 1999b], участвуют во взаимодействии нейтрофилов и образцов цельной крови . Дистантные взаимодействия (ДВ) не ограничиваются односторонним действием одной биологической системы на другую, но включают в себя и двустороннее взаимодействие двух химически изолированных биологических систем [Там же], а также «самовоздействие» [Бурков и др., 2008]. ДВ обнаружены между клетками не только эукариот, но и бактерий [Николаев, 1992]. ДВ имеют место на организменном уровне , на уровне популяций [Бурлаков и др., 1999; Volodyaev and Beloussov, 2007] и, возможно, экосистем .
Следует отметить, что ДВ достаточно слабы, зависят от многих факторов и в ряде случаев возникают трудности с контролем условий экспериментов и воспроизводимостью их результатов. Тем не менее излучение для самой биосистемы может служить ее внутренней системой передачи информации, «атрибутом жизни» [Казначеев и Михайлова, 1985]. С этой точки зрения изучение ДВ важно для понимания координации именно внутриклеточных молекулярных процессов, контроля активности протеинов и координации генетической и биохимической систем, поддерживающих гомеостаз.
Вопрос о функциональной роли ССИ до сих пор дискуссионный, но в любом случае установлено, что ССИ отражает биологическое состояние организмов и их популяционных взаимодействий .
Автореферат диссертации по медицине на тему Межклеточные дистантные взаимодействия в экологическом аспекте: биоиндикация и масс-спектрометрия (изотопия) в услвоиях Крайнего Севера
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ
НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РЕГИОНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОМОРФОЛОГИИ
У "■) " 1 На правах рукописи
МИХАЙЛОВА Людмила Павловна
МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ ДИСТАНТНЫЕ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ЭКОЛОГИЧЕСКОМ АСПЕКТЕ: БИОИНДИКАЦИЯ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ (ИЗОТОПИЯ) В УСЛОВИЯХ КРАЙНЕГО СЕВЕРА
14.00.16 - патологическая физиология
ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук
В ФОРМЕ НАУЧНОГО ДОКЛАДА
НОВОСИБИРСК 1997
Работа выполнена в Научно-исследовательском институте общей патологии и экологии человека СО РАМН
Научный консультант:
Академик РАМН,
доктор медицинских наук, профессор В.П.КАЗНАЧЕЕВ
Официальные оппоненты: Академик РАМН,
доктор медицинских наук, профессор Ю.И.БОРОДИН Академик РАМН,
доктор медицинских наук, профессор С.И.КОЛЕСНИКОВ Член-корреспондент РАМН,
доктор медицинских наук, профессор Л.А.ТРУНОВА
Ведущая организация:
Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра СО РАМН (лаборатория патологической физиологии)
Защита диссертации состоится " // " _ 1997 г.
в /О _ часов на заседании Диссертационного совета Д 001.40.01 в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тима-кова, 2; тел. 8 (383-2) 32-31-56, факс 8 (383-2) 32-43-39.
С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН
Ученый секретарь
Диссертационного совета Д 001.40.01
доктор биологических наук ЕЛЛУШНИКОВА
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Современный этап развития Крайнего Севера, характеризующийся миграцией населения в регионы с суровым климатом, отражается на динамике демографических процессов, и на состоянии здоровья людей. Значение здоровья, как одного из лимитирующих факторов общественного производства, наглядно проявляется в районах нового экономического освоения, особенно на территории Крайнего Севера, в связи с дефицитом трудовых ресурсов.
На человека в этих широтах действует целый комплекс экстремальных факторов, включающих низкие температуры, влажность, сильные ветры, необычный фотопериодизм, гравитационные и гелиогеомагнигные явления, особенности химического состава почвы, воды, воздуха (Данишевский Г.М., 1968; Казначеев В.П., 1973, 1980; Деряпа Н.Р., 1975; Панин Л.Е., 1978, 1986; Авцын А.П. и др., 1985; Бородин Ю.И., 1989). Кроме этих факторов, необходимо учитывать и последствия техногенного воздействия на среду.
Задачи сохранения и развития здоровья человека в специфических природных и производственных условиях северных территорий России должны рассматриваться с позиции современной ашролоэкологии, с учетом как процессов биологической и социальной адаптации пришлого и коренного населения, так и осмысления всего спектра взаимодействия человека и природной среды. По существу, речь идет об исследовании человека и человеческих популяций, находящихся в динамическом взаимодействии с разноплановыми природными антропогенными экологическими комплексами и продуктами своего труда.
Проблемы здоровья человека, живущего и работающего в экологически трудных условиях Крайнего Севера, требуют для своего решения изучения влияния антропоэкологических воздействий различных факторов внешней среды на биосистемы. В настоящее время большое внимание уделяется вопросам добычи и переработки газов Ямальского месторождения, ще особенно большое значение имеет комбинированное воздействие ге-лиогеофизических факторов, воды и газа на организм рабочего-вахтовика. Поэтому проблема изучения хронического воздействия
низких концентраций газа в сочетании с естественными экологических факторами на организм стоит весьма остро.
Один из подходов к решению этой проблемы заключается в определении токсического воздействия ашропоэколошчес-ких факторов на здоровье человека методами биоиндикации с подбором протекторов в вице адаптогенов, биостимуляторов, антиоксидантов и т.д. для профилактики и лечения. Перспективно также использование метода масс-спекгрометрии для определения биологического фракционирования стабильных изотопов углерода и серы (соотношение иС/13С, ^Б/^Б) в экологических исследованиях как маркера загрязнения окружающей среды, что особенно важно на Крайнем Севере в районах тундры в местах нефтегазопромыслов и для определения раннего старения организма человека, обусловленного тяжелыми климатогеохрафическими условиями.
В постановке проблемы охраны окружающей среды часто возникает вопрос о невозможности полного предотвращения антропогенного загрязнения даже в так называемых безотходных технологиях, т.к. для осуществления этих задач требуются чрезвычайно большие материальные затраты. Поэтому вопрос охраны природы можно рассматривать как проблему научно обоснованного нормирования и контроля выбросов, а также сбросов загрязняющих веществ в окружающую среду. В этом аспекте разработка и обоснование способов биоиндикации антропогенных воздействий на природные экосистемы и составляющие их компоненты являются актуальными.
Биоиндикация - это обнаружение биологически значимых антропогенных нагрузок на основе ответной реакции живых организмов и их сообществ. В настоящее время появилось большое количество работ по биоиндикации на клеточном, тканевом, организменном, популяционном и биоценотическом уровнях (Израель Ю.А., Верещагина Т.Н., 1985; Криволуцкий ДА., 1988; Тихомиров НА., 1988; Кошелев Б.В., 1988).
Становится ясным, что для объективной оценки уровня загрязнения окружающей среды и ее воздействия на человека необходимо исследование содержания промышленных токсикантов, в таких ее компонентах, как почва, поверхностные воды, фауна, флора, а также проведение анализа влияния естествен-
ных гелиогеофизических факторов. Преимущество биоиндикаторов, особенно млекопитающих, состоит в том, что они адек-ватноотражают. состояние лриродной среды, а механизмы обменных процессов у них близки человеку.
В современной биологии, медицине, вирусологии широко используется метод тканевых культур. Главное преимущество этого метода - возможность прижизненного наблюдения клеток с помощью микроскопа, поскольку они сохраняют жизнеспособность в течение всего эксперимента, а также оценка со-четанного действия токсикантов, содержащихся в количествах ниже ПДК. Все это позволяет применять метод клеточных культур как метод биоиндикации.
Исследуя антропоэкологические факторы, влияющие на человека на Крайнем Севере, была поставлена цель определения наиболее токсичных для человека факторов. В связи с этим в первую очередь были поставлены вопросы изучения гелиогеофизических факторов: магнитного поля Земли (ГМП), межпланетного магнитного поля (МПМП), солнечной активности и их влияния на организм человека. На Крайнем Севере (65-69-я широты) - арене протекания сложного комплекса электромагнитных явлений, тесно связанных с солнечной активностью, отмечаются большие вариации характеристик возмущений ГМП, которые сказываются на показателях жизнедеятельности организма (Данилов В.И. и др., 1971; Данилов В.И., 1975; Коваль-чукА-В., 1974; Владимирский Б.М., 1977; Казначеев В.П., 1985).
Одной из важнейших экологических проблем крупных промышленных центров на Крайнем Севере (Надым, пос. Ямбург) является проблема питьевой воды, которая, как правило, не соответствует стандартам вследствие загрязнения окружающей среды. Поэтому определение степени токсического влияния питьевой воды на здоровье человека и разработка способов уменьшения токсического влияния являются весьма актуальными. Очевидно также, что для объективной оценки воздействий окружающей среды и уровня ее загрязнения на человека необходимо исследование промышленных токсикантов в ней. В наших исследованиях - это промышленный газ Ямальско-Ям-бургского месторождения, содержащий большое количество углеводородов и продуктов их сжигания.
Цель и задачи исследования. Цель работы - с использованием биоиндикации и масс-спектрометрииизучить характер различных антропоэкологических воздействий на биосистемы в условиях высоких широт и разработать новые критерии оценки воздействия антропоэкологических факторов на организм человека на Крайнем Севере.
Поставлены следующие научно-практические задачи:
1. Изучить применение феномена дистантных межклеточных взаимодействий и метода клеточных культур как тестов биоиндикации.
2. Изучить воздействие различных природных факторов (гелиогеофизических, гипогеомагнитной обстановки, воды, почвы) и загазованности природным и промышленным газом окружающей среды на состояние здоровья жителей этих эко-районов, с использованием метода биоиндикации на различных видах клеточных культур человека и животных.
3. Оценить биологический возраст индивидов на основе определения стабильных изотопов углерода (масс-спектромет-рическим методом) по образцам ногтей и волос, как показателя раннего старения организма.
4. Проанализировать техногенную нагрузку на экосистемы на основе метода биологического фракционирования изотопов углерода и серы (соотношение 13С/13С и "S/^S), как маркера загрязнения окружающей среды.
5. Подобрать с использованием методов биоиндикации протекторы - адаптогены, антиокеиданты, пищевые и витаминные добавки для профилактики и лечения рабочих-вахтовиков на Крайнем Севере.
Научная новизна. Впервые показана возможность использования модели дистантных межклеточных взаимодействий и клеточного монослоя для биоиндикации в экологии, медицине, фармакологии.
Впервые изучено влияние на рост культуры клеток in vitro антропоэкологических факторов. Показано, что метод клеточных культур является адекватным тестом оценки влияния на организм человека токсического действия экстремальных антропоэкологических факторов (гелиогеофизических, питьевой воды, природного газа и т.д.), что позволяет объяснил» механизм их
биотропного воздействия на клетку.
Показана корреляция биологических процессов на клеточном уровне с параметрами гелиогеомагнитной обстановки - временем и местом проведения эксперимента, К-индексом (местным индексом), Ар-индексом, знаком межпланетного магнитного поля, индексом солнечных вспышек. Гелиогеомагнитная обстановка в исследуемой широтной точке оказывает влияние на процессы жизнедеятельности клеточного монослоя.
Показано, что в пшогеомагнитная среда обладает выраженным биотропным эффектом в отношении культуры ткани: происходит снижение жизнеспособности клеточного монослоя, нарушение ритмики деления клеток и усиление феномена дистантных межклеточных взаимодействий.
Впервые при оценке воздействия антропоэкологических факторов, влияющих на адаптационные процессы у рабочих-вахтовиков и жителей этих экорайонов Крайнего Севера, проведен подбор протекторов - адаптогенов, антиоксидактов, пищевых добавок и витаминных комплексов для профилактики и лечения.
Впервые проведено определение степени загрязнения окружающей среды с использованием маркеров изотопов углерода ПС/"С и серы 328/^5 методом масс-спекгроскогши, что особенно важно на Крайнем Севере, в районах тундры, в местах нефтегазопромыслов. Впервые предложено определение биологического возраста методом биологического фракционирования изотопов ПС/13С на основе масс-спектроскопии.
Теоретическая и практическая значимость. Открытие феномена дистантных межклеточных взаимодействий в системе двух тканевых культур (ДМВ) и изучение поведения монослоя клеточной культуры в различных экспериментах дает возможность использовать феномен ДМВ и клеточный монослой как метод биоиндикации воздействия антропоэкологических факторов на человека (на биосистему) в экстремальных условиях Крайнего Севера.
На основании проведенных исследований установлена токсичность питьевой воды в Надыме и в пос. Ямбург, где из трех проб (водозабор воды из Обской губы, воды, очищенной через угольный фильтр, воды из водопровода в больнице) особенно
токсичной, непригодной для приготовления лекарственных препаратов и просто для употребления в качестве питьевой, оказалась водопровод ная вода.
Проведенные исследования по очистке воды показали высокую эффективность использования цеолитовых фильтров, так как после очистки по своим характеристикам вода приближалась к дистиллированой. Сделаны соответствующие рекомендации о применении указанных фильтров, которые были приняты и реализованы в медсанчасти Надыма для больниц, медпунктов и детских учреждений.
Исследование токсичности добываемого газа с использованием культуры клеток показало, что, кроме хронического отравления, газ особенно опасен при аварийной ситуации. Обоснован подбор протекторов, необходимых для применения в случае аварийной ситуации, а также для профилактики при работе на скважинах при заборе газа.
Исследованы и отобраны для практического здравоохранения различные адаптогены, антиоксид анты, пищевые добавки, биостимуляторы-протекторы, корригирующие неблагоприятные антропоэкологические воздействия на организм человека на Севере и для рабочих "горячих" цехов металлургической и газовой промышленности.
В качестве еще одной модели биоиндикации на молекулярном уровне разработана и применена методика биологического фракционирования изотопов для определения биологического возраста человека и использования стабильных изотопов как маркеров загрязнения окружающей среды.
Показано, что у людей молодого возраста (призывников), рожденных на Севере или привезенных в раннем возрасте, и у рабочих 28-30 лет, проработавших на Крайнем Севере более 5 лет могут наступать дизадаптивные состояния, приводящие к нарушению репарационных процессов и к появлению раннего склероза. При масс-спектроскопических исследованиях определяется потеря тяжелого изотопа 13С, т.е. идут нарушения биологического фракционирования, особенно при увеличении северного стажа выше 5 лет, и наступает несоответствие между паспортным и биологическим возрастом.
На основании проведенных исследований разработан спо-
соб оценки биологического возраста человека и рекомендации по отбору, сохранению трудоспособности и решению вопроса трудорезервов для газовиков как на Крайнем Севере (Ямал), так и в средней полосе - Астрахань.
При количественной оценке техногенного загрязнения окружающей среды на основе определения соотношения стабильных изотопов серы "Б/3^ и углерода 12С/13С в газовых промыслах Астрахани установлено появление ^ в почве и растениях, в органах животных на расстоянии 16 км от газоконденсатного завода, снижение изотопа пС в органах животных и увеличение изотопа 12С. В 11 видах растений найден изотоп указывающий на загрязнение почвы. В печени и почках животных, находящихся в зоне выбросов завода (16 км), найден изотоп
Таким образом, показано, что в результате техногенной деятельности человека в зонах наибольшего экологического напряжения имеет место смещение изотопного состава воздуха, почвы, воды и, как следствие этого, происходит изменение изотопного состава, например, в продуктах питания, потенцируются различные экологически обусловленные заболевания.
Научно-практические разработки широко апробированы и внедрены в учреждениях практического здравоохранения, на предприятиях газовой промышленности РАО "Газпром" на Ямале (Надым и Ямбург) и на Астраханском газокоиденсатном месторождении; металлургической промышленности в Магнитогорске. Приняты и утверждены на Ученом совете отдела экологии и медицины РАО "Газпром" две методических рекомендации.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на IX Международном конгрессе по мшфобиологии, вирусологии, эпидемиологии (Москва, 1966); IV Международном симпозиуме по приполярной медицине (Новосибирск, 1978); VIII симпозиуме "Биологические проблемы Севера" (Апатиты, 1980); Советско-немецком симпозиуме по хронобиологии (Москва, 1982); VII Международном семинаре по проблемам биологического действия электромагнитных полей (Прага, 1984); конференции "Магнитобиология и роль ММП в биодинамике" (Москва, 1985); симпозиуме "Биометеорология человека" (Братислава, 1988); Международном симпозиуме ВМ ВОЗ/ЮНЕП "Кли-
мат и здоровье человека" (Леншпрад, 1986); конференции "Непериодические быстропротекающие явления в окружающей среде" (Томск, 1990); Республиканской конференции "Медицинская машигобиолошя - практическому здравоохранению" (Новосибирск, 1991); Международной выставке "ЭКСПО-92" (Испания, Севилья, 1992); Международной медицинской конференции "Проблемы здоровья и нефтяных месторождений в Арктических регионах" (Надым, 1993); Международной конференции "Проблемы охраны здоровья и социальные аспекты освоения тазовых и нефтяных месторождений в Арктических регионах" (Надым, 1995); конференции "О создании единой региональной системы мониторинга окружающей природной среды и здоровья населения Сибири" (Новосибирск, 1996); симпозиуме "Современные проблемы стресса и патологии у жителей Ханты-Мансийского автономного округа" (Новосибирск, 1996); IX International Congress on Circumpolar Health (Anchorage, USA, 1996).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 59 работ, из них 13 статей в центральных журналах, 6 работ опубликовано в зарубежных изданиях. Изданы 3 монографии: "Сверхслабые излучения в межклеточных взаимодействиях" (Новосибирск: Наука, 1981. -144 е.); "Биоинформационная функция естественных электромагнитных полей" (Новосибирск: Наука, 1985. -182 е.); "Принцип относительности градаций живого вещества и проблема слабых взаимодействий" (Новосибирск: Ин-т общей патологии и экологии человека СО РАМН, 1993. - 94 е.). Зарегистрировано открытие N 122 - "Дистантные межклеточные взаимодействия в системе двух тканевых культур" (Офиц. бюл. Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР. -1973. - N19. - С. 3. Открытие N 122 в Государственном Реестре СССР, 1974).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование феномена дистантных межклеточных взаимодействий (ДМВ). В экспериментах использовали как первичную, так и перевиваемую гомологичную культуры. Клетки культивировали на среде 199 Паркера с добавлением 10%-ной
Рис. 1. Схема перемещения положения смонтированных камер во вращающемся барабане.
1 - зона роста культуры в зараженной камере; 2 - зона роста культуры в "зеркальной камере"; 3 - питательная среда
сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков. В качестве экстремальных факторов в работе использованы: биологические агенты - вирус Коксаки А-13 (штамм 401 и 639), вирус классической чумы птиц (БРУ) и аденовирус (штамм 5); химические воздействия - двухлористая ртуть (сулема) и физические факторы - ультрафиолетовая радиация (экспозиция 40-45 с, лампа БУВ-30, расстояние 0,5 см). Кроме того, применяли колхицин, вызывающий не гибель клеток, а нарушение мито-тического цикла.
Культуру ткани, служившую объектом исследования, выращивали в специальных камерах на припаянных ко дну со шлифом кварцевых или стеклянных подложках различной толщины - от 0,2 до 2,0 см. Пропускная способность пластинок в области 280-320 нм составляла 70-90%. Для стекол максимум пропускания лежал в видимой области начиная с 440 нм. После того, как на дне камер образовывался монослой, камеры с внесенным повреждающим фактором монтировали попарно с интакт-ными (монослой к монослою) и закрепляли на вращающемся барабане перпендикулярно оси (рис. 1). Барабан находился внутри затемненного термостата (37°С) и вращался вместе с камерами со скоростью 25 об./мин. Контроль на выявление спонтанной
дегенерации клеток культуры постоянно сопровождал все опыты
Через 2 - 4 суг камеры извлекали, демонтировали, стекла-подложки с выросшими на них клетками отпаивали и после фиксации и окрашивания проводили морфологическое исследование культуры. Учет цитопатического эффекта (ЦПЭ) вели в отношении числа погибших клеток к числу всех клеток и по типу морфологических изменений. Слабоположительный ЦПЭ оценивали как отношение 1:10, средний - 1:15, выраженный -1:20.
Влияние телиогеофизических факторов на жизнедеятельность клеток в условиях высоких широт. Исследования проведены на клеточной перевиваемой линии КН (почка эмбриона человека) в синхронном варианте эксперимента: в Норильске, Надыме и Новосибирске в одно и то же время производили посадку клеточной культуры с использованием культуральных сред и сыворотки одной серии. Культивирование клеток КН проводили по стандартной методике.
Ежесуточно готовили морфологические препараты: выросший на покровном стекле клеточный монослой фиксировали метиловым спиртом и окрашивали гематоксилином-эозином. Проведено гистохимическое определение активности маркерных ферментов сукцинатдещдрогеназы (СДГ) и лактатдещд-рогеназы (ЛДГ). Активность ферментов определяли по методике Нахласса, основанной на восстановлении солей нитросинего тетразолия до окрашенных солей формазана в местах локализации ферментов. Активность выражали в единицах среднего цитохимического индекса (СЦИ).
Рост перевиваемых клеточных культур изучали следующим образом. Исследовали жизнеспособность клеточного монослоя, используя концентрацию клеток 80 тыс/мл для ткани КН, Нер-2 и 100 тыс/мл - для культуры ткани ФЭЧ. Через 6, 12, 24, 48, 72, 96, 144, 168 ч стекла с выросшим на них клеточным монослоем фиксировали метиловым спиртом и окрашивали гематоксилином-эозином и по Фельгену. Результаты обрабатывали с учетом следующих параметров: Бр - количество клеток на единицу площади препарата, которое характеризует плотность роста монослоя; МА - миготическая активность (в %) - количе-
ство делящихся ядер на 100 ядер монослоя.
По срокам появления на стекле определяли тест на "коопе-ративность" клеток (количество клеточных контактов). Для этого клеточную взвесь разливали в пенициллиновые флаконы в концентрации 50 и 100 тыс/мл. Материал фиксировали через 24, 48, 72 ч. Морфологический анализ проводили по указанным выше параметрам.
Эксперименты проводили синхронно в Новосибирске и Норильске во время полярной ночи. Условия опытов строго стандартизованы (вся посуда приготовлена с использованием воды из Новосибирска, питательная среда Версен - одной серии, перевиваемые клеточные линии привезены в Норильск из Новосибирска). Всего проведено три серии экспериментов по 200 флаконов в каждом. Полученные данные обработаны статистически по методике С.Б.Стефанова (1973).
Изучение процессов жизнедеятельности в гипомагнит-ных условиях. Исследования проведены в гипомагнитной камере, состоящей из двух вложенных друг в друга герметичных ферромагнитных экранов. Динамический коэффициент экранирования в полосе частот от 0,1 до 40 Гц для внутреннего экрана не менее 1000, для внешнего не менее 100. При непосредственном измерении статического коэффициента экранирования с помощью магнитометра (чувствительность которого 50 нТл) магнитное поле внутри камеры не обнаруживалось.
Эксперименты проведены на культурах клеток КН, ФЭЧ (фибробласты эмбриона человека), М-15 (фибробласты китайского хомячка), Н (клетки амниона человека).
Исходную маточную клеточную культуру рассаживали на два монослоя, один из которых помещали в гипомагнитную камеру ("гипомагнитная" культура), другой - оставляли в том же термостате вне камеры (контрольная культура). Опытный монослой находился в гипомагнитной камере на протяжении 10-12 пассажей. Каждые 4-5 дней производили параллельную пересадку опытной и контрольной ткани.
В контрольной и опытной культурах клеток подсчитывали митотический индекс. Определяли также индекс пролиферации и плотность роста клеточной популяции на стекле. Кроме того, проводили гистохимическое исследование процесса образова-
ния и накопления в клетках нейтральных липидов, для чего использовали окраску клеточного монослоя Суданом (Ш-Г/)-
Определяли морфологические особенности клеток, растущих в экранированном пространстве.
Оценка воздействия природного газа. В исследованиях использован газ, привезенный с. Ямбургского месторождения. Эксперимент проведен на клеточной культуре КН, которую готовили по стандартной методике. После формирования монослоя (24 ч) воздушную среду заменяли на газ. Воздействие газа было начато с дозы 0,2 мг/мл, но так как данная доза при морфологическом исследовании препаратов не вызвала ЦПЭ, то дозу газа увеличили до 0,3-0,5 мг/мл. Окончательно выбрана рабочая доза газа 0,5 мг/мл, вызывающая дегенерацию ткани. Исследования проводили 3 сут с забором проб для морфологического исследования через 24, 48 и 72 ч.
Анализ воды из источников в местах газодобычи. В качестве модели для исследований использована клеточная культура КН. Клетки культивировали по стандартной схеме в пени-циллиновых флаконах, монослой формировался на по!фовном стекле. В питательную среду, покрывавшую монослой, была введена исследуемая вода в концентрации 10%, входящая в состав сыворотки крупного рогатого скота. Каждые 24 ч готовили морфологические препараты по общепринятой методике с последующей окраской гематоксилином-эозином.
Для исследования взята вода (3 пробы) пос. Ямбург, про-стерилизованная при 120°С при Р- 1-2 атм. Затем один флакон сухой сыворотки разводили исследуемой водой без очистки, другой - водой после очистки и третий - дистиллированной водой. Эти сыворотки в количестве 10% вводили в культураль-ную среду с опытными и контрольными клетками.
Определение количества общего белка в культуре клеток. По окончании культивирования клетки снимали раствором Вер-сена, трехкратно отмывали центрифугированием в растворе Хенкса, после чего разрушали трехкратным замораживанием и оттаиванием. Проводили биуретовую реакцию (использовали стандартный набор реактивов для определения общего белка, модифицированный для клеточных культур) и фотометрирова-ли на спектрофотометре при 540 им против холостой пробы че-
рез 50 мин.
Исследование стабильных изотопов. Использован материал тканей ногтя людей. Ногтевую полоску 1x2 мм отсекали ножницами у людей без видимой грибковой патологии, после чего следовала длительная схема простого промывания образцов с применением ДТА, спирта, акустической обработки и вакуумной сушки. Нативный образец массой 0,1 г помещали в циркуляционный реактор для окисления в чистом кислороде. Полученный диоксид углерода хриогенно очищали от посторонних примесей и подавали в масс-спектрометр для анализа.
Изотопный состав определяли по общепринятой методике на масс-спектрометре фирмы Finnigan MAT-DELTA. Содержание 13С определяли по лабораторному стандарту Д- 1, "С = ± 25, точность определения 0,01. Исследования проведены в Надыме, пос. Ямбург и на о. Диксон.
Для определения биологического возраста людей, работающих в условиях Крайнего Севера, нами были сформированы 3 группы из жителей Надыма и работников Надымгазпрома.
Первая группа - молодые призывники 18 лет (8 человек). Вторая группа - медработники в возрасте от 46 до 60 лет (20 человек). Третья - работники Надымгазпрома в возрасте от 36 до 45 лет (23 человека). В группы отобраны люди, не имеющие явных признаков хронической патологии. У каждого отстригали ногти на руках, пакеты с ногтями шифровали, изотопный анализ проводили по углероду по слепому методу.
Изучение адапатогенного действия растительных препаратов. Исследования проведены на клеточной культуре RH. Клеточную культуру выращивали в матрасах по общепринятой методике. После формирования монослоя клетки снимали со стекла с помощью раствора Версена и рассаживали в пснициллино -вые флаконы по 2 мл (80 тыс.кл/мл). Через сутки культураль-ную среду сливали и заменяли на свежую среду для контрольной культуры, для опытной культуры - на среду 199 плюс адапто-ген. Исследовали экстракт радиолы, экстракт левзеи, настойку лимонника, настойку женьшеня.
Каждые 24 ч в течение 5 сут готовили морфологические препараты по общепринятой методике. Критерием эффекта действия адаптогена служило сравнение морфологической карти-
ны монослоя с адаптогеном и монослоя без него и подсчет ми-тотической активности (МА).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ВЛИЯНИЕ ГЕЛИОГЕОФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ
НА ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТОК КУЛЬТУРЫ ТКАНИ (МЕТОД БИОИНДИКАЦИИ) В УСЛОВИЯХ ВЫСОКИХ ШИРОТ
В связи с появлением все новых неблагоприятных экологических факторов большое значение приобретают исследования по оценке и нейтрализации внешних вредных воздействий. Известные методы исследования базируются на использовании лабораторных животных (от мышей до приматов). Эти методы характеризуются большой трудоемкостью, необходимостью применения специальной аппаратуры, значительной дороговизной и длительностью по срокам исполнения. Кроме того, возникает вопрос об этичности подобных исследований, т.к. в опытах подвергается страданиям и гибнет большое количество животных.
Нами выбран метод (модель) биоиндикации на клеточной культуре человека и животных. Главное преимущество культивируемых клеток - это возможность прижизненного наблюдения клеток с помощью микроскопа. Существенно то,что при работе с культурами клеток в эксперименте используются здоровые клетки и что они сохраняют жизнеспособность в течение всего эксперимента. Убедиться в этом можно периодически тестируя культуру клеток. В опытах на животных состояние почек, например, можно оценить лишь в конце эксперимента, и к тощ же лишь качественно.
Цикл жизни клетки может быть исследован функционально и морфологически. Критерии функции должны быть соотнесены с критериями морфологии на основе состояния всего клеточного массива.
Эффект дистантных межклеточных взаимодействий в экологическом аспекте. В последние десятилетия в нашей стране и за рубежом стали развиваться различные, связанные единой целью, научные направления - биофотохимия, митогенети-ческое излучение (Гурвич А.Г., 1944; Гурвич А.А, 1968), биохе-милюминесценция, электромагнитные межклеточные взаимодействия (коммуникация), биофотоны. Все эти направления схо-
дягся в одном: они предполагают, что физико-химические процессы, протекающие в клетках, обеспечивают информационные взаимодействия биосистем на разных уровнях. Проблема передачи биологической информации, накопления и хранения ее в клетках, а также в тканях и органах в настоящее время приобретает первостепенное значение. Управление известными обменно-грофическими процессами в организме животных и человека невозможно объяснить только нейрогормональными и гуморальными (биохимическими), а также известными биофизическими факторами (изменение различных потенциалов, градиентов и др.).
Вместе с тем еще в ранних работах отечественных ученых (А.Г. Гурвич, Э.С.Бауэр, В.И.Вернадский, АЛ.Чижевский и др.) обоснованно поднимались вопросы термодинамической характеристики процессов жизни, предпринимались попытки изучения информационных механизмов, специфически присущих жизненным явлениям. Факт существования сверхслабого электромагнитного излучения в настоящее время общепризнан и экспериментально обнаружен у всех исследованных клеток растений и животных (Журавлев А.Н., 1965; Тарусов Б.Н., 1967; Конев C.B., Мамуль В.М., 1977).
Возможность передачи биологической информации посредством квантов электромагнитного поля (ЭМП) исследуется нами в течение длительного времени. Предпосылка экспериментов заключалась в том, что функциональное состояние клетки, подвергнутой воздействию различных факторов внешней среды, кодируется в электромагнитном излучении, возникающем в процессе ее жизнедеятельности. Предполагалось проверить, обладает ли это излучение сигнальной функцией, способно ли оно запускать адекватные исходному возбужденному состоянию процессы в интакхных клетках-детекторах.
Поскольку имелось в виду исследование информативных свойств излучения, избраны такие ситуации, когда клетка сталкивается с повреждающими факторами среды. В этом случае адекватный ответ со стороны клеток-детекторов мог быть истолкован однозначно как проявление информативного воздействия.
В качестве факторов воздействия на клетку использовали ДНК и РНК-содержащие вирусы (Коксаки А-13, вирус кури-
ной чумы птиц, БРУ, аденовирус 5 типа), токсические дозы двухлористой ртути, летальные дозы ультрафиолетового облучения и модель управляемого митотического цикла - колхицин. В результате, в клетках развивались повреждения, приводящие к гибели со специфической для каждого из перечисленных агентов картиной. Когда поврежденные соответствующим образом клетки, находящиеся в специальных камерах с кварцевыми окошечками, соединяли с помощью оптического контакта с такими же клетками, не подвергнутыми никакому воздействию, то в последних закономерно развивались характерные изменения, повторявшие картину "болезни" и гибели поврежденных клеток, т.е. проявлялись дистантные межклеточные взаимодействия, обусловленные сверхслабым электромагнитным излучением.
В результате феномен ДМВ обнаружен у всех исследованных нами первичных и перевиваемых гомологичных клеточных культур в разных экологических регионах - средняя полоса России, Подмосковье, Заполярье. Накоплен большой экспериментальный материал, дающий возможность сделать определенные выводы о наличии дистантных межклеточных электромагнитных взаимодействий (электромагнитной биоинформации) в разных экологических регионах Земли. Это позволило предположить универсальность изучаемого явления, хотя морфологическое выражение наблюдаемого взаимодействия, названного нами "зеркальный" ЦПЭ, достаточно специфично для каждого из избранных экстремальных агентов.
Наши данные доказывают, что дистантное электромагнитное межклеточное взаимодействие биологически специфично и, как правило, реализуется только в генетически близкородственных линиях клеток. По мере нарастания гетерогенности линий эффект взаимодействия уменьшается и исчезает.
Если сам эффект взаимодействия отражает некоторое общее свойство клеток различных видов тканевых культур, находящихся в условиях действия разных цитопатических агентов, то морфологическое выражение этого взаимодействия ("зеркальный" ЦПЭ) достаточно специфично для каждого из избранных экстремальных агентов. Специфичность дистантного взаимодействия доказывается тем, что в случае сдвига функционального состояния культуры-индикатора, характеризующегося не гибе-
лью клеток, а торможением деления и роста клеточного монослоя, в "зеркальной" культуре повторяются те же принципиально отличные от гибели сдвиги (модель управляемого мито-тического цикла). Вероятность появления положительного "зеркального" эффекта составила 65 - 85% (для 95%-й доверительной вероятности).
Закономерность проявления "зеркального" ЦПЭ и его универсальность подтверждается статистическим определением по критерию Пирсона эффективности действия трех вирусов, сулемы и УФ-радиации: она оказалась одинаковой. Вероятность же проявления "зеркального" эффекта при управлении мито-тическим циклом ниже, чем при действии летальных экстремальных агентов (57 ±5,3%). Использование цейтраферной микрокиносъемки позволило отметить характерную зависимость ДМВ от стадии развития исходного процесса. Следовательно, описанные межклеточные взаимодействия в тканевых культурах, по-видимому, обязаны механизму, в основе которого заложена возможность специфического управления тем или иным процессом. Если предположить наличие факта длительного управления обменом в "зеркальной" культуре клеток, то следует думать о большом разнообразии и богатстве сигналов. Последовательное поступление сигналов в здоровую клетку в таком случае должно реализовать в ней соответствующую активизацию ферментных систем в строгой последовательности, с электромагнитным излучением определенной частоты и поляризации, при этом для клетки-детектора оно приобретает значение специфического сигнала.
Можно полагать, что для клетки-индуктора излучение представляет обязательное и необходимое проявление ее жизнедеятельности, т.е. речь идет о своеобразных электромагнитных полях, которые для самой клетки являются ее внутренней системой передачи информации, необходимой для жизни самой клетки. Рассматривая сверхслабое излучение живых клеток с информационной точки зрения, можно полагать, что регуляция биологических процессов - одна из функций электромагнитного излучения, испускаемого живыми системами. Излучение регистрируется физическими методами, т.е. может быть идентифицировано как электромагнитное (определенной частоты, очень
низкой интенсивности) в любой точке Земли.
При изучении ДМВ в течение 15 лет обнаружено существование в разных климатических зонах страны сезонной зависимости проявления "зеркального" ЦПЭ. Показано, что "зеркальный" ЦПЭ наблюдался в среднем в 20 - 80% случаев, в зависимости от месяца года, но в то же время регистрировались дни с отрицательным результатом в месяцы с максимальным (80%) проявлением "зеркального" ЦПЭ.
Анализ накопленного материала (свыше 12000 опытов) показывает, что частичную невоспроизводимость экспериментов, осуществляемых при стандартных условиях, трудно объяснить только техническими или методическими погрешностями. Это хорошо согласуется с тем фактом, что воспроизводимость опытов для некоторых культур тканей обнаруживает отчетливый сезонный характер. "Отрицательные" результаты чаще фиксировались зимой. Однако для летнего периода, когда воспроизводимость опытов выше, часть экспериментов давала низкий (либо нулевой) результат. Такая ситуация наводит на мысль о возможности влияния на исход опыта неконтролируемых ге-лиогеофизических факторов.
В связи с этим проведено сопоставление зафиксированного в опытах процента наблюдаемого "зеркального" ЦПЭ с гелио-геофизическими индексами. Результаты анализа позволили выявить корреляцию между проявлением феномена ДМВ и полярностью межпланетного магнитного поля (ММП), а также воз-мущснностью гелиогеомагнитного поля (ГМП). Отрицательная потрешность ММП за несколько дней до эксперимента и отсутствие магнитной возмушенности ГМП сопутствовали проявлению "зеркального" ЦПЭ. При больших возмущениях ГМП (индекс Ар повышен), больших вспышках на Солнце (индекс К) и положительной полярности ММП эффект ДМВ проявлялся слабее или совсем отсутствовал.
Нами отмечено, что в годы активного солнца (1969, 1980) проявление феномена крайне нестабильно: чаще изменялась сезонная зависимость проявления "зеркального" ЦПЭ, а в спокойное время года чаще отмечались дни с 90-100%-ным проявлением "зеркального" ЦПЭ и дни, когда эффект ДМВ отсутствовал совсем. Обнаруженная зависимость эффекта ДМВ от
различных гслиогеофизических вариаций позволила предположить, что проявление этого феномена должно изменяться при широтных перемещениях.
Известно, что 67-я широта является зоной протекания сложного комплекса электромагнитных явлений, тесно связанных с солнечной активностью. Существенно изменяются электромагнитная обстановка и, в частности, структура возмущений ге-лиогеомапштного поля. С целью выявления особенностей электромагнитных взаимодействий и их взаимоотношения с экзогенными полями при широтных перемещениях нами проведены синхронные исследования жизнеспособности клеточного монослоя и феномена ДМВ в различных географических пунктах страны. Отличительной особенностью этих экспериментов явилось, во-первых, то, что в каждом географическом пункте в конкретный момент времени имелась своя специфическая геофизическая и метеорологическая обстановка, обусловливающая локальное влияние ее на биосферу; во-вторых, указанные экологические факторы наряду с локальными проявлениями характеризуются и глобальными эффектами, и поэтому значительные изменения указанных факторов должны отражаться на жизнедеятельности системы синхронно.
Синхронные исследования феномена ДМВ проведены в Норильске и Новосибирске в разные сезоны года в период с 1975 по 1981 г. (всего 500 опытов). Анализ полученных результатов позволяет отметить особенности проявления "зеркального" ЦПЭ на широтах Норильска и Новосибирска.
В первой серии экспериментов обнаружено, что клетки монослоя хорошо распластывались на стекле, процесс их контактирования между собой был выше по сравнению с Новосибирском. Затем с 48-го часа рост монослоя в Норильске проходил более энергично, на плато клетки выходили к 72-му часу, затем в Норильске монослой погибал к концу 6-х суток, в Новосибирске же он был жизнеспособен более 9 суг. В то же время отмечено, что как в Норильске, гак и в Новосибирске пик ми-тотической активности приходился на 24 ч, но в Норильске он был в 2,5 раза выше (рис. 2).
Во второй серии не зафиксировано существенных различий в росте клеточного монослоя в обоих пунктах, митотичес-
Рис. 2. Влияние гелиомагнитной обстановки на монослой клеток в условиях высоких широт по месяцам.
1 - Ар-индекс; К-индекс: 2 - в Новосибирске, 3 - в Норильске; а, б - плотность роста монослоя: 4 - в Новосибирске, 5 - в Норильске; в, г - миготическая активность: 4 - в Новосибирске, 5 - в Норильске.
кая активность клеток в Норильске оказалась в 3 раза ниже по сравнению с клеточной кулыурой в Новосибирске. Особенность роста монослоя в Норильске - наличие двух пиков митотичес-кой активности, приходившихся на 24 и 60 ч (см. рис. 2).
В третьей серии экспериментов установлено, что монослой в Норильске по всем параметрам рос энергичнее: плотность роста и количество ядер на единицу площади в 2 раза выше, чем в
Новосибирске, пик митотической активности, приходящийся на 48 ч, выше в 3 раза. К концу 6-х суток появилось много пик-нотических клеток, и монослой погибал, в Новосибирске в это время он был жизнеспособен более 9 сут.
Проводя исследования на "кооперативность" с целью определения сроков появления монослоя на стекле, мы использовали различные концентрации: 5 х 103, 7 х 103,1 х 105 клеток в 1 мл среды. Установлено, что в Норильске монослой образовывался через 2 сут уже из 5 х 103 клетох/мл среды, а в Новосибирске за то же время из той же взвеси вырастали только отдельные колонии. Этот факт еще раз подтверждает наши данные о том, что в Норильске клеточная культура росла более энергично.
Полученные результаты сравнены с данными по К-индек-су, планетарному индексу (Ар) и по знакам секторов межпланетного магнитного поля, полученным в обсерваториях Норильска и Новосибирска.
В период проведения первого эксперимента по выращиванию культур геофизическая обстановка в Норильске характеризовалась высоким уровнем геомагнитной активности ММП. Начало первого эксперимента совпало с магнитной бурей очень большой интенсивности с внезапным началом и амплитудой возмущения до 1500 нТл, что соответствует К-индексу 8-9 баллов (сумма К за сутки - 36 баллов). Активный период магнитной бури длился три дня, но и после него уровень магнитной активности оставался высоким в течение всего эксперимента. В то же время в Новосибирске интенсивность магнитной бури была меньше (амплитуда возмущения до 330 нТл, что соответствует К-индексу 7-8 баллов (сумма К за сутки - 28 баллов). Продолжительность магнитонапряженного периода в Новосибирске также была меньше.
Таким образом, магнитная активность в период эксперимента сильнее проявилась в Норильске. Этим вероятно, можно объяснить различия в росте монослоя по всем изученным нами параметрам. Видимо, интенсивность роста привела к быстрому истощению монослоя, погибшему на 2-3 сут раньше, чем в Новосибирске. Рост монослоя в Новосибирске был более замедленным и митотическая активность в 2 раза ниже, но кон-
тактирование клеток и ядерно-клеточные отношения выражены лучше, поэтому монослой оказался более жизнеспособным.
При анализе второго эксперимента больших различий в росте монослоя по указанным выше параметрам не отмечено. Оба монослоя жизнеспособны до 9 суг. Это объясняется, по-ввдимому, тем что вариации ЭМП Земли в период опытов были невелики: Ар=8, местные индексы Норильска и Новосибирска соответственно К=17, К=15.
В период третьего эксперимента вновь наблюдалось повышение магнитной активности: в Норильске К=36, в Новосибирске К=20, а Ар=28, т.е. отмечалась напряженная гелиомаг-нитная обстановка. Результаты опыта в какой-то степени повторяли динамику изученных показателей первого эксперимента.
Анализ таблиц знаков секторов ММП показал, что время первого и третьего экспериментов совпадало со сменой знака (+) на (-), что, видимо, в какой-то мере обусловливало сходство результатов обоих экспериментов. Во время второго эксперимента знак сменился с (-) на (+).
Исследование ДМВ в Новосибирске и Норильске проводили также синхронно с 20.01.86 по 23.11.86 г. За время экспедиций проведено 20 экспериментов по 25 опытов в каждом, включая контроль. Впервые "зеркальный" ЦПЭ зарегистрирован в Новосибирске 2.02.86 г. в 40-50% случаев. В Норильске первое проявление "зеркального" эффекта отмечено 23.11.86 г. в 3040% случаев.
Исследования следующей экспедиции, проводившиеся в декабре 1986 г. и январе 1987 г. показали, что вначале "зеркальный" ЦПЭ отсутствовал в обоих пунктах, а с 24 декабря в Новосибирске он начал проявляться с тенденцией к стойкому увеличению до 60-80%. В Норильске во всех опытах эффект отсутствовал до конца февраля 1987 г.
Исследования во время полярного дня (май-июль 1989 г.) показали, что "зеркальный" ЦПЭ в эти месяцы наблюдался как в Норильске, так и в Новосибирске в 40 - 60% случаев в зависимости от дня эксперимента. В то же время отмечались дни с отрицательным результатом, когда эффект не наблюдался.
Феномен ДМВ в Норильске за период исследования проявился во временя полярной ночи, в среднем на месяц позже,
чем в Новосибирске. С конца февраля на данной широте заканчивалась полярная ночь и над горизонтом кратковременно появлялось солнце. Возможно, проявление феномена ДМВ на 69-й широте связано с углом солнца над горизонтом. Во время начала полярного дня "зеркальный" ЦПЭ проявлялся в 40-60% положительных результатов, так же как и в Новосибирске в это время года. Таким образом, нами получена определенная корреляция феномена ДМВ с параметрами гелиогеомагнитной обстановки, временем и местом проведения эксперимента.
В исследованиях, проведенных ранее (1966-1980 г.), отмечена сезонность в проявлении дистантных межклеточных взаимодействий, которая заключалась в том, что в течение 1,5 - 2 мес (декабрь-январь) "зеркальный" ЦПЭ исчезал (исследования в Новосибирске), и начиная с марта до сентября каждого указанного года проявлялся в 60-80%.
В период экспериментов, когда наблюдалась напряженная гелиогеомагнитная обстановка поля (повышенный Ар-индекс, смена полярности межпланетного магнитного поля), выявлялись существенные отличия в жизнедеятельности клеток монослоя. В Норильске рост монослоя происходил энергичнее: плотность роста и количество ядер на единицу площади в 2 раза выше, чем в Новосибирске, пик миготической активности, приходящийся на 48 ч, выше в 3 раза. К концу 6-х суток появлялось много пикнотических клеток, и монослой погибал; в Новосибирске в это время он был жизнеспособен до 9 - 11-х суток.
Более сильной магнитной активностью в период экспериментов в Норильске, вероятно, можно объяснить различия в росте монослоя по всем изученным нами параметрам. Видимо, интенсивность роста привела к быстрому истощению монослоя, погибшего на 2 - 3 сут раньше, чем в Новосибирске. Рост монослоя в Новосибирске был более замедленным и митотичес-кая активность в 2 раза ниже, но контактирование клеток и ядерно-клеточные отношения выражены лучше, поэтому монослой оказывался более жизнеспособным.
Учитывая статистическую достоверность полученного материала, однотипность методики, синхронность экспериментов и одинаковую обеспеченность каждого опьгга, можно предполагать, что различия в результатах зависят не от "внутрен-
них" условий экспериментов, а от воздействия внешних факторов, т.к. все условия исследований в городах Новосибирске и Норильске были идентичны, факторы же гелиогеофнзической обстановки были различными.
Изучая жизнеспособность клеточного монослоя при широтных перемещениях, особенно в высоких широтах во время полярной ночи, мы еще раз убедились в том, что в проявлении феномена ДМВ существует строгая сезонность. Нами был проведен анализ проявления ДМВ за 11 лет и выявлена коррелятивная зависимость проявления ДМВ от гелиогеофизических факторов.
Анализ материала показал, что важнейшими гелиогеофи-зическими факторами являются, по-видимому, амплитудно-спектральные вариации фоновых электромагнитных полей очень низких частот, поэтому в качестве индексов для сопоставления выбраны показатели, отражающие эти вариации: полярность межпланетного поля ("+", "-"), планетарный индекс геомагнитной возмущенности (Ар) (исследования проведены совместно с сотрудником Крымской обсерватории Б.М.Владимир-ским).
Известно, что степень влияния гелиогеофизических фак-, торов зависит во многих случаях от сезона. В связи с этим сопоставление проводили отдельно для зимних и летних месяцев. Все вычисления сделаны на ЭВМ ЕС-1020 с применением метода наложения эпох (Гневышев М.Н., 1983).
Нами использованы каталоги данных Syangaia за 1965-1976 г. (США) и С.М.Мансурова за 1965-1986 г. (СССР), содержащие информацию о межпланетном магнитном поле.
По методу наложения эпох были построены кривые распределения числа случаев нахождения Земли в положительном и отдельно в отрицательном межпланетном магнитном поле, согласно данным С.М.Мансурова.
Значения индекса Ар брали из Международной сводки Solar .geophysical data (США, 1965-1976 г.). Смысл этого индекса - усредненный по ряду магнитных станций размах колебаний горизонтальной компоненты геомагнитного поля. Для спокойных условий Ар равен 2-5; магнитная буря соответствует Ар, равному 50.
Проводили анализ индекса вспышечной активности Солнца (Ю-
Таким образом, ретроспективное сопоставление эффекта ДМВ и роста клеточной культуры с гелиогеофизическими индексами позволило выявить коррелятивную связь феномена ДМВ с полярностью магнитного поля; возмущение геомагнитного поля за несколько дней до посадки также влияло на проявление эффекта. Кроме того, оказалось, что при больших значениях Б-индекса (большие вспышки на Солнце) эффект ДМВ проявлялся слабее и клеточный монослой рос хуже (реже).
Изучение влияния гелиогеофизических факторов Тюменского Севера методом биоиндикации на клеточных культурах. Исследования проводили по той же методике с учетом всех условий эксперимента. В качестве критериев оценки степени влияния природных гелиогеофизических факторов на клеточные культуры в Надыме использовали 4 параметра: митотический индекс - количество на 100 клеток монослоя, выраженное в процентах; плотность роста клеточной культуры (вр) - число клеток монослоя на единицу площади оптической сетки. Полученные таким образом величины митотического индекса (МИ) и плотности роста (Бр) клеточной культуры сравнивали с полученными данными в Новосибирске (контрольная культура). Изменение величин МИ и Бр в Надыме в сравнении с Новосибирском в ту или иную сторону служили критерием оценки степени влияния природных факторов на биосистему (в наших экспериментах - на клеточную культуру линии ЛН).
Оценивали активность маркерных ферментов аэробного (сукцинатдегвдрогеназа, СДГ) и анаэробного (лактатдегидро-геназа, ДДГ) путей метаболизма клетки и скорость роста клеточной культуры. Вычисление последнего параметра разработано в нашей лаборатории для определения прироста плотности роста клеточного монослоя за 1 ч культивирования в течение исследуемых суток:
Скорость роста (СР) = Среднее значение Бр за сутки/24 ч. Скорость роста клеточной культуры является достоверной и точной характеристикой степени активности пролиферации клеток монослоя.
Полученные в Надыме величины МИ и Бр сравнивали с
Таблица 1. Средние величины митотического индекса в Новосибирске и Надыме (М ± ш)
1-й 3.29 ± 1.02* 1.84 ± 0.18
2-й 2.06 ± 0.56 1.50 ± 0.23
3-й 3.57 ± 0.88* 1.89 + 0.61
4-й 2.66 ± 0.45 2.34 ± 0.79
изменением индекса межпланетного магнитного поля Ар, предоставленного Западно-Сибирским метеорологическим центром на период проведения работ в Надыме (с 06.12.93 по 22.12.93 г.).
В результате проведенных исследований установлено, что морфологическая картина клеточного монослоя в Надыме и Новосибирске была следующей: клетки хорошо распластывались на стекле, имели характерную для данной линии геометрическую форму, внутри цитоплазмы хорошо просматривалось правильных размеров клеточное ядро с ядрышками, отмечалась незначительная вакуолизация цитоплазмы. Патологических митозов не было, многоядерность и гигантскоядерность в том и другом случае не превышали величин, установленных в качестве нормы для линии Е.Н (индекс многоядерности - МИ = 3,3; индекс гигантскодцерности - ГЯ=5,5).
Грубых морфологических отклонений в картине монослоя ни в Новосибирске, ни в Надыме не обнаружено, но клеточный монослой в Надыме был значительно реже, чем в Новосибирске, и число митозов в нем снижено.
Средняя продолжительность наблюдения за клеточной культурой в Надыме и Новосибирске составила 8 сут. Определены средние величины митотического индекса клеточной культуры в Надыме и Новосибирске за 8 сут (табл. 1).
Как видно из таблицы, в двух экспериментах из четырех величины митотического индекса клеточной культуры в Надыме и Новосибирске достоверно различались между собой: мито-тическая активность клеток в Новосибирске выше, чем в Надыме.
Определены также средние величины плотности роста кле-
Таблица 2. Средние величины плотности роста клеточной культуры (Бр) в Новосибирске и Надыме (М ± т)
Номер эксперимента Новосибирск Надым
1-й 21.81 ± 2.23* 16.22 ± 0.59
2-й 23.12 ±2.70* 18.33 ± 1.50
3-й 23.51 ± 1.85* 18.16 + 2.68
4-й 23.13 ± 1.27* 18.39 ± 1.43
точной культуры в Надыме и Новосибирске за 8 сут (табл. 2).
Полученные данные свидетельствуют о том, что во всех 4 сериях экспериментов плотность роста клеточной культуры в Новосибирске превышала плотность роста культуры в Надыме.
Изучена динамика роста клеточной культуры в Надыме и Новосибирске.
Определена скорость роста клеточной культуры в Надыме и Новосибирске. Скорость роста клеточной культуры в Новосибирске превышала скорость роста клеток в Надыме в 1,6-2,5 раза, причем сохранялась тенденция к увеличению скорости роста перед пиками миготической активности и уменьшению ее в период после деления клеток. При сравнении изменения скорости роста клеток и изменения Ар-индекса отмечено следующее: между 120-м и 168-м часами культивирования происходил резкий скачок величины Ар-индекса, максимум которого приходился на 144-й час наблюдения. В этот период отмечен положительный прирост скорости роста культуры в Надыме.
Такое явление можно объяснить, на наш взгляд, тем, что клеточная культура в Надыме подвержена воздействию гелио-геофизических факторов высоких широт, которые отсутствуют в Новосибирске. Эти факторы воздействуют угнетающе на рост клеток, что и прослеживается при изменении Ар-индекса.
Выявлены значительные отличия в активности маркерных ферментов жизнедеятельности клеточной культуры в Надыме и Новосибирске (табл. 3).
Как видно из табл. 3, активность СДГ в клетках культуры в
Таблица 3. Активность сукцинатдегидрогеназы в культуре ЕЛ, СЦИ (М ± ш)
72 1.85 ± 0.04 1.91 ± 0.03
96 1.82 ± 0.13 1.99 ± 0.06
120 1.89 ±0.16 2.35 ± 0.07
144 2.15 ± 0.08 2.10 ± 0.03
168 2.30 ±0.07 2.00 ± 0.05
Надыме несколько выше, чем в Новосибирске, причем активность этого фермента в Надыме изменялась менее плавно, с хорошо выраженным пиком на 120-м часе культивирования и спадом в последующие часы наблюдения.
Учитывая, что пик активности и тенденция к возрастанию хорошо коррелируют с показателями зшшгической активности и увеличения плотности роста культуры в период между 72-м и 120-м часом наблюдения, можно предполагать, что для активизации жизнеобеспечивающих процессов культура в Надыме использует большую часть своих резервов, чем клетки в Новосибирске, что приводит к более быстрому истощению энергии в системе фосфорилирования и цикле Кребса. С этим же, по-видимому, связана разница в росте и митотической активности культуры в Надыме и Новосибирске.
Отмечено резкое увеличение активности маркерного фермента анаэробного метаболизма - ЛДГ - в клеточной культуре, находившейся в Надыме (табл. 4). По нашему мнению, это объясняется следующим:
Во-первых, активизация анаэробного метаболизма, как более энергетически дешевого, свидетельствует о попытке скомпенсировать все те энергетические затраты, которые возникли в процессе жизнедеятельности.
Во-вторых, это свидетельствует о возникающем напряжении ферментативной системы гликолиза, и наряду с другими показателями служит объективным критерием дискомфорта и
Таблица 4. Активность лактатдегидрогеназы в культуре КН, СЦИ (М±т)
Время инкубации, ч Новосибирск Надым
72 0.43 ± 0.01 1.06 ± 0.10
96 0.41 ± 0.04 1.02 ± 0.03
120 0.35 ± 0.05 1.76 ± 0.04
144 0.42 ± 0.08 1.19 ± 0.05
168 0.55 ± 0.04 2.00 ± 0.03
дисбаланса в метаболизме клетки.
Учитывая статическую достоверность полученного материала, однотипность методики, синхронность экспериментов и одинаковую обеспеченность каждого опыта, мы можем предполагать, что различия зависят не от "внутренних" условий экспериментов, а от воздействия внешних факторов, так как все условия исследований в Новосибирске, Надыме и Норильске были идентичны, факторы же гелиогеофизической обстановки были различными.
Изучение жизнедеятельности клеточного монослоя в каждой конкретной гео1рафической точке при наличии синхронных гелиобиологических реакций, обусловленных влиянием глобальных космофизических процессов на биосферу, имеет особенности, отражающие экологическую специфику района исследования. Этим мы объясняем наиболее выраженные различия в жизнедеятельности клеточных культур, которые выращивали в средней полосе (Новосибирск, Москва, Симферополь) и в районах Крайнего Севера (Норильск, Надым). Анализируя полученные данные по Надыму (Приполярье) и Норильску (Заполярье), мы видим, что в эксперименте в Норильске воздействие гелиогеофизических факторов более выражено и при определенной гелиогеомапштной ситуации может привести к ранней гибели клеточного монослоя. В то же время в Надыме нами отмечено, что гелиогеофизические факторы на этой широте (64*) воздействуют угнетающе на жизнеспособность клеточного мо-
нослоя, но монослой жизнеспособен и не погибает.
Анализ полученных результатов позволяет сделать заключение об особенностях проявления жизнеспособности клеточного монослоя на различных широтах и при различной гелиоге-офизической обстановке.
Таким образом, получена определенная корреляция биологических процессов на клеточном уровне с параметрами гелио-геомагнитной обстановки, временем и местом проведения эксперимента по К-индексу (местным индексом), Ар-индексу, знаку межпланетного магнитного поля, индексу солнечных вспышек. Гелиогеомагаитная обстановка в исследуемой широтной точке, по нашим данным, может играть определенную роль в жизнедеятельности клеточного монослоя. В настоящее время экспериментальные наблюдения и теоретические исследования дают основания считать геомагнитное поле ответственным за биологические эффекты функционирования живых организмов.
На эти вопросы можно в значительной мере ответить при проведении синхронных экспериментов с использованием искусственных магнитных полей. Работы по экранированию биологических объектов интересны тем, что в них делается прямая попытка полностью освободиться от воздействия геомагнитного поля или, по крайней мере, сильно уменьшить его влияние.
Таким образом, накопленные факты позволяют рассматривать метод клепочных культур и ДМВ как перспективный метод биоиндикации различных внешних воздействий, особенно в тех случаях, когда природа действующих факторов сложна и многообразна. Достоверные методы биоиндикации приобретают большое значение в связи с развитием экологических исследований, требующих количественной оценки биологических реакций на уровне целых биосистем, проявляющих свойства ин-техрагивности.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ В ГИРОМАГНИТНЫХ УСЛОВИЯХ
Биологические эффекты ггатомагнитных полей изучены мало, и сведения относительно возможных последствий пребывания различных биологических объектов в таких полях противоречивы.
Защита от действия внешних ЭМП может проводиться двумя способами - активным и пассивным. Активная защита заключается в том, что чувствительный прибор измеряет величину внешнего поля и управляет током в катушках, которые создают магнитное поле, равное по величине и направленное противоположно действующему; тем самым компенсируется действие внешнего поля.
Однако из-за размеров катушек активная защита работает хорошо лишь на низких частотах, поэтому наряду с активными методами защиты от магнитных полей применяется пассивный, заключающийся в экранировании от внешних полей. Существует три типа экранов: из материалов с высокой электропроводностью (алюминий, медь), сверхпроводящие и ферромагнитные (Введенский ВЛ., Ожогин В.И., 1982).
Ферромагнитный экран - наиболее распространенный тип магнитной защиты в технике. Действие его основано на том, что магнитный поток через сечение экрана концентрируется в стенках с высокой магнитной проницаемостью и тем самым ослабляет поле во внутреннем пространстве.
В наших экспериментах в "гипомагнитной" культуре, начиная с 4 т- 5-го пассажа (16 - 25-й день эксперимента), появлялись признаки неспецифической дегенерации: клетки долго не разворачивались на стекле, поздно начинали делиться, имели более плотное, иногда пикнотичесхи сморщенное ядро, окруженное узким ободком цитоплазмы. В последующих пассажах монослой экранированной культуры сильно разрежен, клетки приобретали отростчатую нейроподобную форму; ядра в них были уплотнены. Встречалось много дегенерирующих клеток с лизи-рованными или пикнотически сморщенными ядрами. Митоти-ческие клетки меньших размеров, плотнее, чем обычно, похожи на пикнозы. С 4-5-гхэ пассажей в опытной культуре встречались многоядерные и гигантские полиплоидные клетки, а также многочисленные патологические многополюсные митозы, ацентрические фрагменты и мосты в стадии анафазы.
Спустя 2 сут после посадки в "гипомагнитной" культуре только-только начинали образовываться клеточные колонии, тогда как в контрольной ткани за то же время и при той же посадочной концентрации уже вырастал ровный густой монослой.
// пассажа
Рис. 3. Изменение МА - митотической активности (а) и Бр - плотности роста монослоя (б) при культивировании клеток в гипомагнигных условиях. 1 - контроль; 2 - гипомагнишая обстановка.
С начала эксперимента и до 5 - 6-го пассажей митотичес-кий индекс клеточной культуры, растущей в гипомагнитной камере, значительно, иногда в 1,5-2 раза, был выше контрольного (рис. 3). Такое положение сохранялось до 18 - 20-го дня пассирования, а затем митотический индекс опытного монослоя резко падал, и уже до конца эксперимента (до полной дегенерации культуры) он оставался ниже, чем в контрольном монослое.
Обе культуры ("гипомагнитная" и контрольная) имели синхронный пик митотической активности, приходящийся на 48 ч, причем смещение пика на 24 ч происходило одновременно. Обе кривые митотического индекса на протяжении всего опыта хорошо коррелировали между собой. Проведенные исследова-
ния не выявили разницы в ориентировке метафазной пластинки в опытных и контрольных препаратах.
Плотность роста на стекле при одной и той хе посадочной концентрации в опытном монослое была всегда меньше, чем в контроле, причем от пассажа к пассажу эта разница возрастала от 1,5-2,5 до 8-10 раз. С 7-го пассажа плотность роста клеток в гипомагнитной камере не нарастала по часам, а к 10-му пассажу опытная культура погибала, тогда как контрольный монослой еще оставался жизнеспособным.
Индекс пролиферации (отношение числа выросших клеток к числу засеянных) у "гипомагнитной" ткани постепенно снижался от 3,25 до 0, оставаясь в контрольной культуре сравнительно стабильным - 2,25-4,25.
Отмечалось заметное снижение адгезивной способности "гипомагнигного" клеточного монослоя, а также значительное уменьшение продолжительности версенизации культуры (процесса отделения клеток от стекла под действием раствора Вер-сена при пересадке) - до 0,5-1 мин.
Гистохимические исследования выявили повышенное по сравнению с контролем накопление нейтральных липидов в клетках культуры, растущей в экранированном пространстве. Более четко эта разница проявлялась с 5-го по 6-й пассажи, когда показатели "гипомагнитной" культуры выше контрольных в 7 - 9 раз.
Часть клеток опытной культуры при очередном перепассаже (7) была отсажена в другой матрас и возвращена в условия ГМП. При этом через 8 дней (2-й пассаж) культура полностью восстановила нормальную морфологическую картину и не отличалась от контрольного монослоя. Клетки теряли отростчатую форму, округлялись, начинали интенсивно делиться, образуя новые колонии и по плотности роста приближаясь к контролю.
Культура ткани, выращенная в пшомагнитных условиях, использовалась нами в опытах по ДМВ в качестве детектора дистантных взаимодействий. Оказалось, что эффективность ДМВ при такой постановке эксперимента значительно возрастает ("зеркальный" ЦПЭ проявлялся в 95 - 96% парах камер), т. е. чувствительность "гипомагнитной" культуры к специфическому сигналу, закодированному в сверхслабом излучении пора-
женных клеток, возрастала.
Таким образом, полученные нами экспериментальные данные позволяют расценивать гшхомагнитную среду как фактор, обладающий выраженной биологической активностью для клеток культуры ткани.
Значительное увеличение миготической активности свидетельствует о том, что глубокое и длительное экранирование культуры приводит к изменению жизнедеятельности клеточного монослоя. Увеличение числа патологических митозов в опытной "гипомагн итной" культуре свидетельствует об изменении различных механизмов митоза, в частности о нарушении нук-леопротеидного обмена клетки. В гипомагнитной камере уменьшалась прочность прикрепления клеток к стеклу, индекс пролиферации постепенно понижался до нуля, т. е. происходило угнетение процессов жизнедеятельности клетки с развитием дегенерации культуры и гибелью клеточного монослоя.
Обратимый характер развивающейся дегенерации (при переносе культуры в условия естественного электромагнитного поля) подтверждает тот факт, что именно экранирование явилось причиной его развития.
Анализ данных, полученных в 1983 - 1984 г., показывает, что падение напряженности геомагнитного поля отражается на жизнедеятельности многообразных типов клеток. Приведем данные по трем разновидностям клеточных культур. Наиболее чувствительной к гипомагнитной обстановке оказалась клеточная культура ФЭЧ (фибробласта человека). Она дегенерировала к 3
4-му пассажу. Менее чувствительной была перевиваемая культура ПН (перевиваемая почка человека), дегенерирующая только к 10-му пассажу идо 5-го пассажа дающая "усиление" роста в 2
12 раз. Более стойкой оказалась клеточная культура НЕр-2 (рак гортани). Она росла активнее контрольной примерно в 1,5
3 раза до 7-го пассажа, а после этого выдерживала уменьшение напряженности внешнего магнитного поля до 10 - 12-го пассажа.
В гипомагн иггных условиях, по нашим данным, наблюдалось нарушение ритмики деления клеток в культуре. Полученные результаты свидетельствуют о высокой чувствительности внутриклеточных биологических процессов (митозов) к изме-
нению напряженности магнитного поля.
Таким образом, проведя серию экспериментов на жизнеспособность клеточного монослоя, проявление эффекта ДМВ и изучение клеточного цикла в пшомагнитных условиях, мы пришли к выводу, что биосистема не может длительное время существовать в гипомагнитной среде (вакууме).
Экранирование изменяет биохимию клетки, приводя к повышенному образованию и накоплению внутриклеточных нейтральных лшщцов, повышает чувствительность клетки к действию экстремальных агентов и сверхслабого излучения, нарушает ритмику деления клетки. Следовательно, электромагнитная среда является для биосистемы жизненно необходимым элементом организации (устойчивой неравновесности), необходимой средой их жизни. (
ОЦЕНКА. АНТРОПОЭКОЛОГНЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ
ПРИРОДНОГО ГАЗА ЯМАЛЬСКОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ БИОИНДИКАЦИИ НА КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ
Изучено биотоксическое действие газа Ямальского месторождения с мест газодобычи пос. Ямбурга методом биоиндикации на клеточной культуре.
Исследования были разделены на несколько этапов:
Определение дозы газа, влияющей на жизнеспособность клеточного монослоя, т.е. определение токсичности газа при 1фатковременном воздействии (острое отравление);
Оценка длительного воздействия газа на клеточный монослой (хроническое отравление);
Создание моделей аварийной ситуации на клеточной культуре человека (острое отравление) с подбором протекторов для спасательной службы.
При исследовании влияния газа на клеточную культуру в дозе 0,5 мг/мл (острое отравление) наблюдалась следующая морфологическая картина: монослой клеток разрежен, клетки с вакуолизированной цитоплазмой и измененным хроматином. Встречались клетки с изменениями в ядре, когда хроматин сконцентрирован в глыбки, вокруг ядерной мембраны хорошо просматривался светлый ободок. Наблюдалось небольшое количество пикнотизированных клеток. Монослой был жизнеспособным.
При моделировании хронического отравления клеточный монослой культивировали в течение 10 сут при воздействии газа в дозе 0,7 мг/мл. Через 4 сут производили смену среды и вновь добавляли газ. Задачей данного исследования являлось определение возможности хронического отравления данным газом. При морфологическом исследовании культуры клеток наблюдалась следующая картина: в первые сутки культивирования в ядрах хорошо просматривалась мембрана ядра, но хроматин (ядерное вещество) сжат в пикнотическую массу, вокруг которой отмечался ободок просветления, т.е. основные изменения регистрировались в ядре.
На 5-6-е сутки появлялись признаки дегенерации, а к 10-м суткам монослой погибал, наблюдалось хроническое отравление малыми дозами газа, приводящее к гибели клеточного монослоя. Контрольная культура, в которой проводилась смена питательной среды без добавления газа, оставалась жизнеспособной.
Отмечено достоверное снижение количества общего белка в культуре с газом в сравнении с контрольной культурой при длительном культивировании клеток (10 сут). Изменение накопления белка в опытной культуре при сравнении с контрольной свидетельствует о снижении пролиферативной активности клеток, особенно в том случае, когда токсикант контактировал с клетками достаточно долго.
Таким образом, газ Ямбургского месторождения содержит большое количество углеводородов и в силу своей "летучести" мало ядовит, но при длительном воздействии вызывает хроническое отравление, при этом в основном страдает ядро клетки. Учитывая, что газ этого месторождения обладает свойством быстрого испарения в воздушную среду, особенно в летнее время, можно заключить, что отравление рабочих может наступить только при аварийной ситуации, что и показано нами на клетках, где газ замещал воздушную среду и вызывал медленное хроническое отравление.
При создании модели аварийной ситуации (острого отравления) мы взяли дозу 0.7 мг/мл, рассчитывая на получение острого отравления клеточного монослоя.
Задача данного исследования - подбор протектора, необ-
ходимого для ликвидации острого отравления. В качестве протектора нами применен миддронат и различные витаминные добавки В1, В6, В12, в качестве антиоксиданта аскорбиновая кислота, а также глюкоза, отобранные нами при исследовании газа Астраханского месторождения. Газ и протектор вносили в 24-часовую культуру клеток тремя способами:
1. Добавление протектора в питательную среду с клеточной культурой за 2 ч до введения газа (протектор - 2ч - газ);
2. Одновременное введение газа и протектора;
3. Добавление протектора в питательную среду с клеточной культурой через 2 ч после воздействия газа (газ - 2ч - протектор).
При добавлении протектора за 2 ч до введения газа через 24-48 ч мы наблюдали редкий монослой с единичными пикно-тизированными клетками, цитоплазма мало вакуолизирована. Через 72 ч монослой был редким, но жизнеспособным; наблюдались единичные митозы.
При одновременном введении протектора и газа наблюдалась следующая картина: монослой клеток разрежен, клетки с вакуолизированной цитоплазмой и измененным хроматином в ядре. Встречались клетки, в которых хроматин в ядре был сконцентрирован в глыбки, наблюдался ободок просветления вокруг мембраны ядра. Отмечалось большое количество пикноти-зированных клеток, но монослой частично жизнеспособен.
При введении протектора через 2 ч после введения газа к 24-48-му часам наблюдался редкий монослой клеток. Через 72 ч возрастало количество погибших клеток, а также клеток с длинными цигоплазматическими отростками и пикнотизированны-ми ядрами. Монослой нежизнеспособен (погибал).
Таким образом, результаты исследований по изучению воздействия газа при аварийной ситуации показали, что отравленному человеку необходимо вводить миддронат, аскорбиновую кислоту, как антиоксидант, и весь витаминный комплекс, указанный выше. С профилактической целью при заезде каждой новой партии вахтовиков рекомендуется прием милдроната в капсулах (по 1 капсуле в течение 10 дней) и витаминного комплекса
Метод биоиндикации на клеточных культурах может при-
меняться в экологических исследованиях окружающей среды для определения токсического действия на биосистему таких ант-ропоэкологических факторов, как природный газ.
ИССЛЕДОВАНИЕ ВОДЫ ИЗ МЕСТНЫХ ИСТОЧНИКОВ В МЕСТАХ
ГАЗОДОБЫЧИ ЯМБУРГА МЕТОДОМ БИОИНДИКАЦИИ
НА КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
Одной из важнейших экологических проблем крупных промышленных центров является питьевая вода, которая, как правило, не соответствует стандартам вследствие загрязнения окружающей среды. Поэтому нам представлялось актуальным определение степени токсического влияния водопроводной воды на здоровье человека и разработка способов уменьшения такого влияния.
Определена степень токсического влияния на клеточную культуру воды, взятой с водовода Обской губы, из водопровода пос. Ямбурги воды, прошедшей очистку через угольные фильтры в лаборатории ЦНИПР. Осуществлен подбор состава фильтров для очистки воды.
Результаты исследования воды, взятой с водовода Обской губы: клеточный монослой через 24 ч был представлен единичными колониями, которые сливались в редкий монослой. К 72-м часам наблюдались единичные митозы, патологических митозов не обнаружено. Клетки хорошо распластывались. К 120-му часу монослой был сравнительно густым, ядро с ядрышками хорошо просматривались, но цитоплазма была вакуолизированной. Встречались гигантские и пикнотизированные клетки (погибшие), но монослой оставался частично жизнеспособным.
Результаты исследования воды, взятой из водопровода больницы: к 48-му часу клеточный монослой редкий, цитоплазма вакуолизирована, мембрана ядра хорошо контурирована, ядрышки в ядре не различались. К 72-м часам отмечалась сильная вакуолизация цитоплазмы и жировое перерождение клеток. К 96-120-и часам монослой погибал.
Результаты исследования воды, очищенной путем озонирования и адсорбирования в лаборатории ЦНИПР: монослой был жизнеспособным, клетки образовывали монослой к 48-и часам. Цитоплазма была менее вакуолизированной, глыбок ли-
пидов не было. Количество митозов снижено, встречались гигантские и пикнотизированные клетки. Монослой был более жизнеспособным, чем в первом случае.
Из полученных данных следует, что водопроводная вода из больницы является токсичной и отрицательно влияет на жизнеспособность клеток. Вода из водовода Обской губы менее токсична, но и она снижает жизнеспособность клеток. Вода, очищенная в лаборатории ЦНИПР, не прекращает жизнедеятельность клеток. Тем не менее все три пробы не являются экологически чистыми и пригодными для жизнеобеспечения биосистемы. В связи с этим, наряду с угольными, необходимо использование цеолитовых фильтров.
При определении общего белка в клеточной культуре получены следующие результаты (Т - величина обратно пропорциональная количеству белка, в %).
Контрольная культура (дистиллированная вода) - 92.4 ± 0.20. Опытная культура: водопроводная вода 97.5 ± 0.95, вода с водозабора 96.2 ± 0.35, вода, очищенная ЦНИПР 93.8 ± 0.53.
Таким образом, отмечено достоверное снижение количества общего белка в культурах с добавлением исследуемых проб воды по сравнению с контролем. Изменение накопления белка в опытной культуре относительно контроля свидетельствует о снижении пролиферативной активности клеток, т.е. о снижении жизнеспособности клеточного монослоя. Полученные данные подтверждают результаты прижизненного морфологического наблюдения монослоя в длительном эксперименте.
Использование цеолитовых фильтров для очистки питьевой воды в условиях вахты по данным метода биоиндикации. Нами предложен метод очистки водопроводной воды с помощью цеолитовых фильтров. В очищенной через цеолитовый фильтр воде содержание нефтепродуктов практически равно нулю, вода не дает осадка, прозрачна. Этот фильтр поглощает из воды тяжелые металлы, железо, болезнетворные микроорганизмы, бензопирен.
При сравнении препаратов через 24, 48, 72, 96, 120 и 144 ч различий в морфологической картине между монослоем с водой очищенной, неочищенной и дистиллированной почти не
наблюдалось. Клетки хорошо распластывались, ядро в них было овальной формы, в ядре видны ядрышки. Митозы и вакуолизация цитоплазмы не отмечались. С 24-го по 72-й час возрастала плотность роста (количество клеток на ед. площади), через 96120 ч плотность роста оставалась неизменной.
Достоверного различия в количестве общего белка между клеточной культурой, культивированной с очищенной водой и дистиллированной не обнаружено.
Таким образом, вода после очистки цеолитами становилась нетоксичной или минимально токсичной. Клетки, культивируемые в среде, содержащей очищенную воду, сохраняли жизнеспособность длительное время. Такие же результаты получены при исследовании водопроводной воды в Надыме.
СТАБИЛЬНЫЕ ИЗОТОПЫ КАК МАРКЕРЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО ВОЗРАСТА ЧЕЛОВЕКА (МЕТОД БИОИНДИКАЦИИ)
Систематическое изучение биологического круговорота веществ и его роли в развитии биосферы начато довольно давно (Вернадский В.И., 1926; Галимов Э.М., 1980). Уникальным инструментом для изучения в живом веществе биологических циклов оказался метод стабильных изотопов. Он дает необходимую информацию о распределении элементов в организме, что нашло широкое применение в области экологии, медицины и т.д.
Фракционирование является очень чувствительным индикатором к изменениям химического окружения, количеству и силе связей в молекуле, ее химическому потенциалу, температуре, при которой протекает реакция.
Биологическое фракционирование стабильных изотопов заключается в том, что в живых организмах наблюдается также обогащение изотопом углерода ("С) по отношению к содержанию этого изотопа в углекислом газе вдыхаемого воздуха. Появление его связано с так называемым нормальным кинетическим изотопным эффектом, в соотношении с которым скорость химических реакций возрастает при участии более легких атомов. В ферментативных биохимических реакциях могут возникнуть также термодинамические изотопные эффекты, с которыми связано накопление тяжелых изотопов при увеличении энергии хими-
ческой связи.
Под изотопным составом понимают относительную распространенность изотопов данного элемента, выраженную обычно в виде отношения малораспространенного изотопа к наиболее распространенному (Д/Н) 12С/13С, "Б/3^, 160/180 и т.д.
На основе явления биологического фракционирования стабильных изотопов углерода и серы нами предложена методика получения количественной характеристики степени загрязнения окружающей среды и ее воздействия на организм человека путем масс-спектрометрического определения соотношения изотопов углерода и серы в организме человека. Это позволило оценить экологическое состояние окружающей среды и здоровье человека в норме и патологии (атеросклероз, гипертоническая болезнь, катаракта и др.). Степень биологического фракционирования стабильных изотопов предлагается рассматривать в качестве биологического маркера степени загрязнения окружающей среды и критерия определения биологического возраста (раннего старения) рабочего-вахтовика.
В результате технической деятельности человека в зонах наибольшего экологического напряжения имеет место смещение изотопного состава воздуха, почвы, воды и, как следствие этого, изменение изотопного состава в продуктах питания (Га-лимов Э.М.). Полученные ранее результаты показали (Казначеев В.П., Ржавин А.Ф.), что патологические процессы (атеросклероз, катаракта, СКВ, ССД) действительно характеризуются накоплением легкого изотопа, свидетельствующим об отклонении от равновесия, присущего биосистеме в норме.
Возникает вопрос: "Является ли наблюдаемый эффект изотопической трансмутации следствием процессов естественного старения человеческих тканей или результатом нарастающего относительного дефицита фракций углерода 13С?"
Было сделано предположение, что длительное действие повреждающих факторов через физико-химические механизмы нарушения адаптационно-ретуляторных функций на уровне организма найдет свое отражение в биологическом фракционировании стабильных изотопов углерода как при естественном старении организма, так и действии повреждающих факторов - ге-лиогеофизических, природного газа и таких, как длительное
действие низких температур и тд.
Результаты наших исследований показали, что у людей, проживающих как на Крайнем Севере (Надым, Ямбург), так и в средней полосе (Магнитогорск, Астрахань), работающих на газовых промыслах и предприятиях тяжелой металлургии с влиянием на них высокой загазованности, изменением температурных режимов, по сравнению с нормой (эталоном), имело место систематическое снижение изотопа 13С.
По-видимому, в нормальных условиях существования человека наблюдаемый эффект изотопического фракционирования является следствием старения человеческих тканей, а в тяжелых экологических условиях - нарастающий относительный дефицит тяжелых фракций углерода может быть, по нашему мнению, показателем биологического времени и проявления раннего старения организма.
В норме, с увеличением паспортного возраста человека возрастает атеросклеротическое поражение организма, при этом масс-спектрометрическое определение отмечает незначительное плавное снижение содержания изотопа 13 С в образцах ногтей. Для получения возрастного распределения биологического фракционирования проведены измерения 20 образцов ногтей людей в возрасте от 5 до 70 лет. В интервале величины 13С от -20.1 до 23.5 %о была получена плавная кривая фракционирования изотопов углерода в зависимости от возраста, которая в дальнейшем использовалась как контроль (рис. 4). Таким образом, кривая фракционирования изотопов углерода 13С, полученная масс-спегароскопически из образцов ногтя человека, может являться интегральным показателем энергетической напряженности всех обменных процессов (выражающихся в скорости реакций, участвующих масс, химическом потенциале и тд.) в организме человека.
В первой труппе из 8 обследованных у 3 уже отмечалось, хотя и незначительное, но отклонение в соотношении стабильных изотопов (-22.4 %о и -23.2 %о), т.е. уже в подростковом возрасте необходимо проводить изотопические исследования и выделять группы риска, которые должны находиться под врачебным наблюдением. Этим, видимо, и объясняется большое количество подростков 16-18 лет с юношеской гипертонией в Надыме.
1935 1940 1945 1950 1955 1960 1965 1970
Рис. 4. Данные по биологическому возрасту рабочих и служащих Ямбурггаздобыча в 1996 г.
У работников Надымгазпрома, находящихся в тяжелых климатических и физических условиях, биологический возраст не соответствует паспортному - выше. Здесь 10 человек должны также быть выделены в группу риска. Те же данные были получены и у медработников медсанчасти Надыма (-23.4 %о, -24.0 %о) (см. рис. 4).
Необходимо также отметить, что у работников Надымгазпрома биологический возраст несколько больше, чем у медработников, напрямую не связанных с тяжелым физическим трудом в экстремальных холодных условиях. Примерно 19 работников необходимо выделить в группу риска для дальнейшего обследования.
В экспериментах Диксон - Новосибирск проведены масс-спекгроскопические исследования (критерий биологического возраста). Набран материал от 70 человек. Две группы рабочих подобраны по возрасту и стажу по 25 человек (от 1 до 5 лет, и от 5 до 10 лет стажа) и одна группа населения, проживающего в
Новосибирске, взята в качестве контроля. Материалом исследования были образцы тканей ноля людей в возрасте 36-40 лет, проживающих на о Диксон не менее 5 лег и 10 лет.
Результаты исследования показали, что у людей на Крайнем Севере по сравнению с нормой (Новосибирск) имело место систематическое снижение изотопа 13С, что было особенно очевидно у лиц, проживших на Севере 10 лет. В материале, взятом от них, степень фракционирования возросла до -27.45 %о при норме -23.55 %о (т.е. -3.9 %о)
На Ямбурге при обследовании вахтовиков взят материал (ногти) дм определения биологического возраста от 16 человек, которые разделены на две возрастные группы: 1-ю составляли лица в возрасте 28-34 года, 2-ю - в возрасте 35-47 лет, и 1 человек в возрасте 57 лет. В возрастной группе (28-34 года) со стажем работы до 5 лет обнаружено нарушение соотношения стабильных изотопов иС/13С только у одного человека, перенесшего болезнь Боткина. В группе с 34 до 47 лет нарушение соотношения с уменьшением изотопа 13С выявлено у 6 человек, из них у 5 человек отмечено повышение артериального давления, т.е. гипертоническая болезнь. Это все рабочие, имеющие стаж работы на газонефтяных промыслах на Крайнем Севере не менее 8 лет и до 19 лет. У 4 человек из 5, больных гипертонией, отмечалось раннее склерозирование и раннее старение организма.
В исследуемой группе при одном и том же паспортном возрасте величина изотопа ЦС в указанном соотношении разная; его потеря отмечена у 4 человек, которые выделены в группу риска. По нашему мнению, здесь вдут процессы раннего склерозирования, а затем нарушения биологического возраста. Такие рабочие должны получать профилактическую помощь в виде протекторов (антиоксидантов, антитоксикантов), витаминов, бальзамов и тд., повышающих адаптивные процессы организма.
Использование метода масс-спектроскопии биологического фракционирования изотопов как маркера загрязнения о!фужающей среды. На основе явления биологического фракционирования стабильных изотопов углерода и серы нами предложена методика получения количественной характеристики степени за!рязненяя окружающей среды. Проведены исследо-
вания по выявлению изотопа 345 как маркера загрязнения окружающей среды, находящегося в промышленных выбросах определенных производств (газовые промыслы Астрахани, металлургической промышленности Магнитогорска, Надыма).
Сера, в основном, находится во всех живых организмах в виде стабильного изотопа 32Б, а изотоп находящийся в клетках и тканях организма составляет менее 1% от общей серы. Общее ее количество в тканях животных и растений сильно варьирует - от десятых долей процента до 9% в пересчете на сухую массу.
Исследования проведены на Астраханском газовом месторождении, для которого характерно содержание в газе большого количества изотопа и8, что явилось основанием для использования его в качестве маркера. Исследовали содержание изотопов в тканях печени и почек белых крыс как в норме (Астраханский заповедник), так и находившихся в условиях серосодержащей атмосферы газоперерабатывающего завода, а также в Астрахани.
Проведенные исследования показывают, что у крыс, находящихся в атмосфере завода, произошло утяжеление по изотопу содержащейся серы в печени и почках за счет техногенной компоненты (Б = 6.5%), по сравнению с нормой (Б = 5.5%). В образцах печени животных в группах Астраханского заповедника и города изотопного сдвига не обнаружено.
При исследовании почвы в районе Астраханского заповедника и Астрахани, по изотопу были получены результаты, которые четко показали зону воздействия выбросов завода на расстоянии 16 км в сторону Астрахани. Составлен соответствующий протокол, в котором указано, что газоконденсатный комбинат не имеет никакого отношения к загрязнению окружающей среды Астрахани, т.к. отстоит от него на 60 км, но загрязняет окружающую среду нескольких поселков (по розе ветров), находящихся в указанной 16-километровой зоне.
Проведенные исследования по определению содержания вышеуказанных изотопов серы в растениях 17 видов, взятых на расстоянии 6 км от завода, показали наличие изотопа 34Б в 11 видах, что указывает на загрязнение почвы.
В печени и почках суслика, находившегося в 16-километровой зоне выброса, также обнаружено наличие этого изотопа.
При исследовании почвы и растений по маркеру углерода 12С/13С на Ямбурге мы обнаружили увеличение легкого изотопа "С в растениях (органике), по сравнению с растениями, взятыми в Новосибирске. В почвах произошло разделение пробы на лесок и почву. В почве легкого изотопа углерода "С больше (35.5%), чем в песке (25.8%), в почве Новосибирска его содержалось 22%.
Таким образом, разработанные критерии определения биологического возраста по биологическому фракционированию стабильных изотопов углерода позволяют подойти к решению вопросов оценки здоровья человека, а вместе с тем и вопросов трудоустройства, сохранения трудорезервов, проведения профилактических, терапевтических и организационных мероприятий. Метод дает интегральную характеристику адаптационной способности организма человека при неблагоприятном воздействии окружающей среды и позволяет дифференцировать нозологические формы заболеваний адаптивного напряжения (гипертоническая болезнь, склероз и тд.), соответственно назначать корригирующую терапию подбором протекторов - адапто-генов, антиоксидантов.
В современной социально-гигаенической ситуации, сложившейся в стране, и неспособности нашей медицины охватывать большие группы населения полноценным профосмотром, особенно в отдаленных районах со слаборазвитой инфраструктурой, важна разработка таких методов диагностики ранних патологических отклонений в организме человека, с помощью которых ее можно проводить быстро и эффективно, что позволило бы своевременно и более экономно оказывать корригирующее воздействие на население этих районов.
В тяжелых экологических условиях нарастающий относительный дефицит тяжелых фракций углерода может быть первопричиной изменения биологического времени и появления раннего старения организма.
Метод биологического (метаболического) фракционирования стабильных изотопов углерода, серы оказался уникальным инструментом для изучения живых организмов, поскольку обеспечивает необходимой информацией биологов и экологов, помогает дифференцировать антропогенные нагрузки.
ПОДБОР ПРОТЕКТОРОВ, АДАПТОГЕНОВ, АНТИОКСИДАНТОВ
ДЛЯ ОРГАНИЗАЦИИ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЙ ПОМОЩИ
И ОБЛЕГЧЕНИЯ АДАПТАЦИИ РАБОЧИХ-ВАХТОВИКОВ И ЖИТЕЛЕЙ КРАЙНЕГО СЕВЕРА
Проблему адаптации нужно рассматривать всегда имея в виду социальный компонент. Но социальная адаптация всегда исторически конкретна. Относительно человека мы должны говорить об адаптивной и адаптирующей системе, т.е. не только приспосабливающейся, но и изменяющей параметры среды и характер ее воздействия. Импонирует именно адаптивно-адаптирующий механизм здоровья - не просто существование, не просто труд и жизнь, но активный труд, противостоящий воздействиям окружающей среды.
Известно, что для условий Севера нужен другой набор продуктов, чем в жарких странах. Несомненно, что разнообразная пища, т.е. разнообразный набор химических соединений, играет большую роль в современных условиях жизни человека. Это разнообразие определяется всем набором видов мяса, рыбы, овощей, фруктов, приправ и пряностей. Они привносят в организм не только ограниченный набор витаминов, но и большое количество самых разнообразных биологически активных веществ (БАВ).
Антиоксиданты - это БАВ, для которых характерен широкий и разнообразный спектр влияния на функционирование и структуру различных систем организма. К природным антиокси-дантам или биооксидантам относятся вещества растительного и животного происхождения, тормозящие развитие свободнора-дикальных процессов окисления.
Адаптогены, в основном, используются в качестве тонизирующих средств, повышающих психическую и физическую работоспособность. В регионах Крайнего Севера - это вещества, регулирующие адаптивные свойства организма.
Как известно, витамины - это низкомолекулярные органические вещества, абсолютно необходимые для обеспечения биохимических и физиологических процессов в организме. При недостаточном обеспечении организма витаминами развиваются специфические патологические состояния - пшо- и авитаминозы, характеризующиеся расстройством в той или иной сте-
пени всех видов обмена веществ и нарушениями различных функций организма. Дефицит витаминов возникает вследствие многих причин, из которых главными являются недостаточное содержание их в пищевом рационе и увеличенная потребность организма в витаминах, помогающих человеку сохранить здоровье.
Все это очень остро касается рабочих-вахтовиков, т.к. данная группа должна пройти процесс адаптации более ускоренно и желательно без дизадаптивных синдромов, и затем после окончания вахты вновь пройти адаптацию на своем основном месте жительства.
Задача данного исследования - подбор адаптогенов, ан-тиоксвдантов, витаминов и др., повышающих жизнеспособность и резистентность клеточных культур к воздействию гелиогеофи-зических факторов, с одной стороны, с другой стороны, необходим был подбор таких веществ (антиоксидантов, биостимуляторов), которые взяли бы на себя роль протекторов, защищающих организм человека от токсического воздействия добываемого природного газа. Для решения этих задач был использован клеточный монослой.
На модели клеточного монослоя это возможно, хотя в природе клетки, организмы и популяции обычно адаптируются к комплексу естественных условий внешней среды, действие которых на организм взаимосвязано, и выделить ведущее значение одного фактора из всего комплекса трудно.
При подборе адаптогенов, защищающих клеточный монослой от воздействия гелиогеофизических факторов, мы остановились на веществах растительного происхождения. Исследования проводились в Надыме по общепринятой методике. Проведено 6 серий экспериментов с каждым адалгогеном на клеточной культуре (табл. 5).
В наших исследованиях установлено, что МА клеточного монослоя, культивированного в присутствии адаптогенов, выше, чем у контрольного. Контрольный монослой находился под воздействием условий внешней среды, и это влияние ничем не компенсировалось, кроме внутренних резервов клеточного пула; МА в таких условиях снижался. При использовании адаптогенов-про-текгоров клеточная пролиферация значительно усиливалась,
Таблица 5. Изменения митотической активности (МА) клеточной культуры в зависимости от применяемого адаптогена, %о (М±т)
Адаптоген МА через 24 ч МА через 48 ч
Экстракт радиолы 1.07 ± 0.20 2.10 ± 0.39
Экстракт левзеи 1.22 ± 0.26 2.40 ± 0.46
Настойка лимонника 1.34 ± 0.29 2.60 ± 0.47
Настойка жень-шеня 1.53 ± 0.31 3.00 ± 0.38
Контроль 1.02 ± 0.15 2.00 ± 0.32
причем наибольшим модулирующим эффектом обладают биоактивные вещества женьшеня. Аномальных митозов не обнаружено.
При исследовании протектирующих свойств препаратов предварительно все они проверялись на собственную возможную токсичность по отношению к клеточному монослою.
В качестве протекторов нами было исследовано 12 препаратов Института органического синтеза Латвийской республики, предложенных нам для испытаний в качестве биостимуляторов для защиты от воздействий различных экстремальных факторов внешней среды и токсических веществ, в том числе природного газа и продуктов его сжигания.
При исследовании на токсичность обнаружено, что часть препаратов обладает сильными токсическими свойствами даже в минимальных концентрациях, что не позволило использовать их в дальнейших экспериментах.
Исследования протекторных свойств препаратов при действии природного газа на клеточный монослой проводили в трех сериях опытов:
Протектор в рассчитанной нетоксической концентрации добавляли в кулыуральную среду за 4 ч до введения газа;
Протектор и газ вводили одновременно;
Протектор вводили через 4 ч после воздействия газа.
Параллельно с этим проводили контрольные опыты, т.е.
культивировали клеточную культуру с добавлением газа без про-
хекгора. Также проверяли токсичность растворителя в том случае, если протектор не растворялся в воде.
При применении препаратов с выраженными протекторными свойствами в тех случаях, когда протектор вводили одновременно или за 4 ч до воздействия газа, цитопатический эффект газа проявлялся незначительно (гибель клеток составляла 10-15% от общего числа клеток в монослое). В случае применения протекторов через 4 ч после воздействия газа защитные свойства препаратов снижались, и в течение 24 - 48 ч погибало 7080% от общего числа клеток. Через 72 ч клеточный монослой погибал, оставались единичные мелкие колонии клеток. При одновременном введении протектора в первые 48 ч наблюдалась гибель 40% клеток, но через 72 ч монослой почти восстанавливался.
Вторая группа препаратов отличалась по защитным свойствам от вышеописанных тем, что при введении одновременно с газом и за 4 ч до воздействия газа доля погибших клеток составляла 35-40% через 24-48 ч, и монослой частично восстанавливался через 72 ч. В случае, когда протектор вводили через 4 ч после воздействия газа, гибель клеток составляла до 90% от общего числа клеток монослоя, и монослой погибал полностью.
Слабопротекторные препараты не защищали клеточный монослой. В результате проведенных исследований была выделена группа препаратов - милдронат, леокадин, форидон, которые можно рекомендовать для применения в качестве протекторов при хронических и острых отравлениях природным газом, а также в профилактических целях.
Среди них можно выделить препарат милдронат, который внедрен в практическую медицину. Милдронат - аналог убуга-робетаина, предшественник карнитина. Препарат повышает работоспособность, уменьшает симптомы физического и психического напряжения, регулирует систему клеточного иммунитета, является ашипгаоксантом, уменьшает количество мет-гемоглобина в крови, является противоаллергическим средством.
Проведена работа по детальному изучению его как протектора при отравлении газом Ямальского месторождения. Все исследования протекгирующей активности проводили методом биоиндикации на клеточных культурах при введении специаль-
но подобранной токсичной дозы газа - 0,7 мг/мл, которая вызывает почти полную дегенерацию клеточного монослоя всех линий культур. Милдронат проверяли на острую и хроническую токсичность и экспериментально подбирали такую концентрацию препарата, которая защищала клетки от поражения газом или значительно снижала степень поражения клеток.
Полученные результаты позволили сделать вывод, что во всех концентрациях милдронат нетоксичен для клеточного монослоя, который морфологически не отличался от контрольного. Более того, было установлено, что он обладает стимулирующим действием на клеточный монослой, увеличивая его проли-феративную активность.
Милдронат в концентрациях от 2 до 0,5 мг/л, а также в концентрации 0,2 мг/л, оказывал выраженное протекторное действие на клеточный монослой в том случае, если он вводился в культуральную среду одновременно с газом или за 4 ч до воздействия газа. При введении миддроната через 4 ч после воздействия газа на клеточный монослой отмечено, что в первые 24 и 48 ч клеточный монослой гибнет и остаются лишь небольшие участки живых клеток, но через 72 ч после воздействия отмечено восстановление клеточного монослоя, но не до полного объема.
Полученные данные показали, что во всех испытуемых концентрациях (от 0,01 до 0,1 мг/л) милдронат нетоксичен и обладает выраженным стимулирующим действием на клеточный монослой, следовательно, он может быть использован не только как протектор, но и как стимулятор после вредного воздействия окружающей внешней среды.
Нами исследованы различные витамины: аскорбиновая кислота (антиоксидант), витамины труппы В (1, б, 12), витамин Е (токоферол) и др., которые вместе с 10% глюкозой вводили в питательную среду клеточных линий Л-41 и КН. Все эти витаминные добавки усиливали жизнеспособность клеточного монослоя (увеличивалась плотность монослоя, возрастало количество митозов и т.д.).
Кроме витаминов, в последнее время стали использовать различные пищевые добавки, стимулирующие адаптационные процессы. Для целей нашего исследования мы выбрали препа-
раты Эйконол-1, Эйконол-2 (вытяжки из трески и морского краба) и препарат "Марина" из морских водорослей, содержащий большое количество йода. По рекомендации изготовителей, данные препараты могут нормализовать состояние анти-оксццантной защиты организма, ликвидировать дисбаланс в содержании микроэлементов в организме, нормализовать микрофлору кишечника, ускорить выведение из организма солей тяжелых металлов, радионуклидов.
В процессе определения токсичности пищевых добавок Эйконол-1, Эйконол-2 и препарата "Марина" установлено, что в концентрации 0,5 мг/л Эйконол-1 и Эйконол-2 нетоксичны, а в концентрации 2 мг/л токсичны: происходит разрежение клеточного монослоя, клетки плохо распластаны на стекле, цитоплазма вакуолизирована. Полученный водный раствор препарата "Марина" нетоксичен.
Дальнейшие исследования проводили с нетоксическими концентрациями препаратов. Исследования на наличие протек-тирующей активности проводили по той же схеме.
Эйконол-1, Эйконол-2: через 24 и 48 ч после воздействия газа и протектора наблюдался слабый щггопатический эффект (разрежение монослоя в сравнении с контролем, появление клеток нетипичной формы, сильная вакуолизация цитоплазмы, количество пикнотизированных клеток достигало 25-30%). Через 72 ч культивирования происходило восстановление клеточного монослоя, через 96 ч - плотность роста опытного монослоя превышала контрольную, т.е. можно говорить о наличии у Эйконо-ла-1 и Эйконола-2 эффекта, стимулирующего рост клеток.
Препарат "Марина": через 24 и 48 ч после воздействия газа и протектора наблюдалась картина цитопатического эффекта, количество пикнотизированных клеток достигало 35-40%, восстановление клеточного монослоя происходило через 96 ч; активного стимулирующего эффекта на клеточный монослой не установлено.
Таким образом, пищевые добавки Эйконол-1 и Эйконол-2 обладают слабопротекюрным эффектом при воздействии природного газа на клеточный монослой и обладают выраженным стимулирующим эффектом на рост клеточной культуры линии Л-41.
Пищевая добавка "Марина" практически не обладает про-
текгорными свойствами по отношению к природному газу и обладает слабовыраженным стимулирующим действием на рост клеточной культуры.
Полученные данные по отбору антиоксцдантов, адаптоге-нов, витаминов, пищевых добавок и миддроната, как протекторов, позволили рекомендовать их для профилактики дизадап-тации вахтовиков на Крайнем Севере (в Ямбурге, Надыме) и на газовом месторождении Астрахани. Препарат миддронат, витамины - аскорбиновая кислота, токоферол (В-Е) с успехом применены как в профилактических, так и лечебных целях при аварийной ситуации, а также при лечении хронических заболеваний бронхолегочной системы и язвенной болезни двенадцатиперстной кишки на газоконденсатном заводе в Астрахани, металлургическом комбинате Магнитогорска и Надыма.
1. Морфофункциональные показатели клеточной культуры (как модели биосистемы) могут служить надежными критериями биоиндикации различных экологических и техногенных воздействий: экстремальных гелиогеофизических факторов, техногенных загрязнений воды, воздуха и почв. Показана корреляция изменений биологических процессов на клеточном уровне с параметрами гелиогеомагнитной обстановки - временем и местом проведения эксперимента, К-индексом, Ар-индексом, знаком межпланетного магнитного поля и индексом солнечных вспы-
2. При высокой гелиогеомагнитной активности в условиях высоких широт рост клеточного монослоя более интенсивен, но гибель наступает быстрее, что связано с перенапряжением адаптационных механизмов в условиях Крайнего Севера и быстрым истощением регенераторного потенциала.
3. Метод клеточных культур является наиболее информативным для тестирования феномена дистантных межклеточных взаимодействий, который отражает фундаментальное свойство биосистем (клеток) - способность передавать информацию посредством электромагнитных излучений.
4. Гипогеомагнитная среда является фактором, обладающим выраженным биологическим эффектом в отношении клеток
культуры ткани. Показано снижение жизнеспособности клеточного монослоя, нарушение ритмики деления клеток и увеличение эффективности феномена дистантных межклеточных взаимодействий в гипогеомагнитной среде. Чувствительность "гипо-магнитной" культуры к специфическому сигналу, закодированному в сверхслабом излучении пораженных клеток, выше, чем контроле.
5. В зонах наибольшего экологического напряжения имеет место смещение изотопного состава воздуха, воды и почв, и, как следствие, регистрируются изменение изотопного состава продуктов питания и экологически обусловленные заболевания. На основе феномена биологического фракционирования стабильных изотопов углерода и серы предложен универсальный метод оценки экологического статуса региона, позволяющий получить количественную характеристику степени загрязнения окружающей среды.
6. Установлено, что метод биологического фракционирования изотопов углерода (12С/13С) является надежным критерием определения биологического возраста человека. В регионах Крайнего Севера выделены группы людей среди призывников и рабочих-вахтовиков с нарушениями биологического фракционирования стабильных изотопов (потерей тяжелого изотопа 13С). На основании проведенных исследований разработаны рекомендации по отбору и сохранению трудоспособности рабочих как на Крайнем Севере, так и в средней полосе России.
7. На основе проведенных исследований установлена токсичность питьевой воды в местах газодобычи. Особенно токсичной, непригодной для употребления в пищу является водопроводная вода. Показана возможность ее очистки с помощью цео-литовых фильтров.
8. Биоиндикация на клеточном монослое позволила выявить токсичность добываемого на Ямале газа. Установлено, что кроме хронического отравления особенно опасно отравление газом при аварийных ситуациях. Разработаны методы профилактики для работающих на скважинах при заборе газа.
9. С использованием метода биоиндикации исследованы и рекомендованы для практического здравоохранения различные адаптотены, антиоксиданты, пищевые добавки и биостимуля-
торы-протекторы, корригирующие неблагоприятные антропо-эколотческие воздействия на организм человека в условиях Севера, а также в металлургической и газовой промышленное -ж
10. Накопленные экспериментальные данные позволяют рассматривать метод клеточных культур и феномен дистантных межклеточных взаимодействий как перспективный тест для биоиндикации различных экстремальных факторов, особенно в тех случаях, когда природа действующих факторов сложна и многообразна или недостаточно ясна.
1. Влияние гепарина на клетки злокачественных опухолей в культуре ткани // Бюл. экспер. биол. - 1967. -№3.- С. 85 - 88 (соавг. Часовских Г.Г. и др.).
2. Значение сверхслабых световых потоков в механизме ци-топатического действия вирусов // IX Международный Конгресс по микробиологии. - М., 1967. - С. 509.
3. Влияние культуры ткани, зараженной вирусом Кокеаки А-13, на "зеркальную" интакгную культуру (сообщение 1) // Полупроводниковые термочувствительные сопротивления в биологии и медицине. - Новосибирск, 1967. - С. 197 - 201 (соавт. Игнатович Н.В.).
4. Влияние культуры ткани, зараженной вирусом классической чумы птиц (БРУ), на "зеркальную" интакгную культуру (сообщение 2) // Полупроводниковые термочувствительные сопротивления в биологии и медицине. - Новосибирск, 1967. - С. 202 - 205.
5. Информационная роль сверхслабых световых потоков в биологических системах (сверхслабые световые потоки в механизме ЦПД вируса К-А 13 - сообщение 1) // Вопросы биофизики. - Новосибирск, 1967. - С. 20 - 24 (соавг. Казначеев В.П. и ДР-)-
6. Информационная роль сверхслабых световых потоков в биологических системах (сверхслабые световые потоки в механизме ЦПД вируса классической чумы птиц - БРУ - сообщение И) // Вопросы биофизики. - Новосибирск, 1967. - С. 25 -
27 (соавт. Казначеев В.П., Шурин С.П.).
7. Информационная роль сверхслабых световых потоков в биологических системах (сверхслабые световые потоки в механизме ЦОД сулемы - сообщение III) // Вопросы биофизики.
Новосибирск, 1967. - С. 28-29 (соавт. Казначеев В.П., Шурин С.П. и др.).
8. О межклеточных дистантных взаимодействиях в системе двух тканевых культур, связанных оптическим контактом // Сверхслабые свечения в биологии. - Москва, 1969. - С. 28.
9. О межклеточных дистантных взаимодействиях в системе двух тканевых культур, связанных оптическим контактом // Сверхслабые свечения в биологии. - Москва, 1972. - С. 224 - 227 (соавт. Казначеев В.П. и др.).
10. Distant intercellular interaction in a system of two tissue cultures U Chemistry. -1973. - № 2. - P. 37 - 39.
И. Информационные взаимодействия в биологических системах, обусловленные электромагнитным излучением оптического диапазона Ц Прогресс биологической и медицинской кибернетики. - М., 1974. - С. 314 - 338 (соавт. Казначеев В.П.).
12. Distant intercellular interaction in a system of two tissue cultures // Psychoeneigetic systems. -1976. - Vol. 1. - P. 141 -142.
13. О роли сверхслабых световых потоков в биосистеме // Биоэнергетика и биологическая спектрофотометрия. - М., 1977.
С. 80 - 85 (соавт. Казначеев В.П. и др.).
14. Дистантные межклеточные взаимодействия и особенность роста клеточного монослоя в условиях высоких широт // Материалы IV Международного симпозиума по приполярной медицине. - Новосибирск, 1978. - С. 120 - 122.
15. Дистантные межклеточные взаимодействия, вызываемые УФ излучением // Фотобиология животной клетки. - Ленинград, 1979. - С. 221 - 223 (соавг. Сударев В.К. и др.).
16. Определение условий возникновения феномена дистантных межклеточных взаимодействий при УФ-радиации // Бюл. экепер. биол. - 1979. - № 5. - С. 168 -171 (соавг. Радаева И.Ф. и ДР-)-
17. Эффективность проявления дистантных межклеточных взаимодействий в зависимости от количества клеток в монослое и экстремального агента // Деп. в ВНИИТИ. - 28 мая 1979,
JSfe 187879 (соавт. Казначеев В.П. и др.).
18. Изучение дистантных межклеточных взаимодействий в системе двух гетерогенных и клеточных культур // Деп. в ВИНИТИ. - 1979, № 256379 (соавт. Немцов Е.В. и др.).
19. Гетерогенные клеточные культуры в дистантных межклеточных взаимодействиях // Материалы Всесоюзной конф. по адаптации под ред. акад. А.М.Чернухина". - Москва, 1980. - С. 229 (соавт. Карташова Н.Б. и др.).
20. Дистантные межклеточные взаимодействия и гелиомаг-нитная обстановка в условиях высоких широт // Материалы VIII симпозиума "Биологические проблемы Севера". - Апатиты, 1980.
С. 229 - 230 (соавт. Радаева И.Ф. и др.).
21. Особенности адаптивной реакции клеточного монослоя на гелиогеомагнитную обстановку // Современные проблемы общей патологии в аспекте адаптации. - Новосибирск, 1980. - С. 19 - 29 (соавт. Казначеев В.П., Карташова Н.Б.).
22. Дистантные межклеточные электромагнитные взаимодействия в системе двух тканевых культур // Бюл. экспер. биол. - 1980. - № 3. - С. 337 - 339 (соавгт. Казначеев В.П., Карташова Н.Б.).
23. Влияние гелиогеомагнитной обстановки на клеточный монослой в условиях высоких широт // Биологические проблемы Севера. Адаптация человека к условиям Севера. - Кировск, 1980. - С. 108 - 109 (соавт. Казначеев В.П., Радаева И.Ф.).
24. Жизнеспособность клеточной культуры почки эмбриона человека и влияние на нее некоторых факторов // Возрастные особенности морфологии и физиологии почек человека. - Новосибирск, 1981. - С. 43 - 52 (соавт. Зенков Н.К., Карташова Н.Б.).
25. Сверхслабые излучения в межклеточных взаимодействиях.
Новосибирск: Наука, 1981. - 144 с. (соавт. Казначеев В.П.).
26. Солнечная активность и частичная невоспроизводимость экспериментов по цитопатическому "зеркальному" эффекту // Солнечные данные 1982 г.: Бюллетень Кг 4. - Л.: Наука, 1982. - С. 108 - 110 (соавт. Владимирский Б.М. и др.).
27. Пятнадцатилетний опыт изучения геомагнитной цикличности методом тканевых культур // Материалы советско-немецкого симпозиума по хронобиологии и хрономедицине. - М.,
1982 (соавт. Карташова Н.Б.).
28. Влияние гелиогеомагаитной обстановки на монослой ■ - ■ : > » клеток и дистантные межклеточные взаимодействия в условиях высоких широт // Влияние солнечной активности на биосферу. - М.: Наука, 1982. - С. 63 - 73 (соавт. Казначеев В.П., Радаева И.Ф.).
29. Влияние гелиогеомагнигной обстановки на монослой клеток и дистантные межклеточные взаимодействия в условиях высоких широт И Проблемы космический биологии. - М.: Наука, 1982. - Т. 43. - С. 63 - 73 (соавт. Радаева И.Ф. и др.).
30. Исследование процессов жизнедеятельности в гипомаг-нитных условиях // Материалы VII Международного семинара по проблемам биологического действия ЭМП. - Прага, ЧССР, 1984. - С. 29 - 30 (соавт. Зайцев Ю А).
31. Биоинформационная функция естественных электромагнитных полей. - Новосибирск: Наука, 1985. - 182 с. (соавт. Казначеев В.П.).
32. Особенности роста клеточного монослоя в гипомагнит-ном поле // Материалы конференции "Магнитобиология и роль ММП в биодинамике". - М., 1985. - С. 25 - 27 (соавт. Зайцев ЮА).
33. Влияние гелиогеофизических факторов на жизнеспособность клеточной культуры и дистантные межклеточные взаимодействия // Материалы конференции "Магнитобиология и роль ММП в биодинамике". - М., 1985. - С. 42 - 45.
34. Исследование процессов жизнедеятельности клеточного монослоя в гапомапштных условиях // Бкш. Сиб. отд-ния АМН СССР. - 1986. - № 3. - С. 12 - 16 (соавт. Иванова М.П., Зайцев ЮА).
35. Problems of evolutional-biophysical biometeorology // Symposium of human biometeorology. - Czechoslovakia, 1988. - P. 3 (соавт. Трофимов AB. и др.).
36. Дистантные межклеточные взаимодействия в экологическом аспекте // Методологические проблемы экологии человека: Сб. науч. трудов. - Новосибирск: Наука, 1988. - С. 130 - 137 (соавт. Иванова М.П.).
37. Theoretical metodological base cosmic anthropoecology. The influence of stable magnetic field over sympathoadrenocortical system
// Symposium of human blometeorology. - Czechoslovakia, 1988. - P. 6.
38. Изменение жизнеспособности клеточного монослоя почки человека под влиянием гелиогеофизических факторов при широтных перемещениях // Труды Международного симпоз. ВМО ВОЗ/ЮНЕП "Климат и здоровье человека". - Ленинград, 1988.
Т. 2. - С. 68 - 72 (соавт. Харина Н.И. и др.).
39. Эффект дистантных межклеточных взаимодействий в экологическом аспекте // Симпозиум по биометеорологии. - Братислава, 1988. - С. 33 (соавт. Казначеев В.П., Игнатович Н.В.).
40. Метод клеточных культур и дистантные межклеточные взаимодействия как тест биоиндикации внешнего влияния // Симпозиум по биометеорологии. - Братислава, 1988. - С. 33 (соавт. Казначеев В.П., Харина Н.И.).
41. Дистантные информационные процессы в биосистемах // Непериодические быстропротекающие явления в окружающей среде: 2-я Всесоюзная междисциплинарная научно-техническая школа-семинар. - Томск, 1990. - С. 80 - 86.
42. Возможность подбора протекторов методом биоиндикации при воздействии природного газа Астраханского газокон-денсатного месторождения // Газовая промышленность. - 1990.
N 1. - С. 57 - 58 (соавт. Меренкова А.Г. и др.).
43. Метод биоиндикации в исследованиях природного газа Астраханского газоконденсатного месторождения // Газовая промышленность. -1990. - N 3. - С. 32 - 34 (соавт. Фельдман ПЛ., Меренкова А.Г.).
44. Милдронат как протектор при отравлении природным газом АГКМ // Газовая промышленность. - N 4. - С. 27 - 28 (соавт. Фелвдман ПЛ., Меренкова А.Г.).
45. Подбор протекторов при воздействии природного газа / / Газовая промышленность. - 1991. - N 12. - С. 31 (соавт. Куцин П.В.).
46. Влияние ослабленного геомагнитного поля на устойчивость клеточной культуры к ядам (сулеме) // Материалы Респ. науч.-практ. конф. «Медицинская магнитология - практическому здравоохранению». - Новосибирск, 1991. - С. 38а (соавт. Игнатович Н.В., Фельдман ПЛ.).
47. Принцип относительности градаций живого вещества и
проблема слабых взаимодействий. - Новосибирск, 1993. -■ 96 с. (соавт. Чередниченко Ю.Н.).
48. Метод биоицдикации влияния гелиогеофизических факторов на жизнеспособность биосистемы в условиях Крайнего Севера // Международная медицинская конф. «Проблемы здоровья и нефтяных месторождений в Арктических регионах». - Надым, 1993. - С. 25 - 27 (соавт. Меренкова А.Г., Фельдман ПЛ.).
49. Поведение клеточной культуры НеР-2 в период столкновения кометы Шумейкеров-Леви с Юпитером // Веста. МИКА им. Н АКозырева. - 1994. - Вып. 1. - С. 39 - 40 (соавт. Шкурах ПА.).
50. Определение биологического возраста по соотношению стабильных изотопов углерода у человека в различных экологических условиях Крайнего Севера // 2-я Межд. научно-пракг. конф. «Проблемы охраны здоровья и социальные аспекты освоения газовых и нефтяных месторождений в Арктических регионах». - Надым, 1995. - С. 56 (соавт. Ржавин А.Ф. и др.).
51. Изучение влияния водопроводной воды г.Надыма на жизнеспособность и метаболизм клеточной культуры человека методом биоиндикации // 2-я Межд. науч.-практ. конф. «Проблемы охраны здоровья и социальные аспекты освоения газовых и нефтяных месторождений в Арктических регионах». - Надым, 1995. - С.48 (соавт. Игнатович Н.В., Гапонова Е.С.).
52. Оценка степени биологического фракционирования изотопов как количественный маркер воздействия окружающей среды на организм человека и показатель патологических нарушений // Бюл. Сиб. отд-ния РАМН. -1996. - N1. - С. 55 - 59 (соавт. Ржавин А.Ф., Игнатович Н.В.).
53. Исследование факторов внешней среды, влияющих на экологаю изучаемого района методами биоиндикации // Науч.-практ. конф. «О создании единой региональной системы мониторинга окружающей природной среды и здоровья населения Сибири». - Новосибирск, 1996. - С. 82 - 83 (соавт. Игнатович Н.В., Гапонова Е.С.).
54. Оценка степени биологического фракционирования изотопов как количественный маркер воздействия окружающей среды на организм человека и показатель патологических нару-
шений // Науч.-практ. конф. «О создании единой региональной лтстемы мониторинга окружающей природной среды и здоровья населения Сибири». - Новосибирск, 1996. - С. 116 - 117 (соавт. Фридман Ю.М. и др.).
55. Изучение влияния водопроводной воды г.Ханты-Ман-сийска на жизнеспособность и метаболизм клеточной культуры человека методом биоиндикации // Современные проблемы стресса и патологии у жителей Ханты-Мансийского автономного округа. - г. Новосибирск, 1996. - С. 99 (соавт. Игнатович Н.В., Гапонова Е.С.).
56. Assessment of influence degree of environmental ecological factors on a human according to a biological fractionation marker of stable carbon and sulphus isotopes // 10-th International Congress on Circumpolar Health. - Anchorage, Alaska, U.SA. - May 9 - 24,1996. - P. 12 - 13 (соавт. Фридман Ю.М., Игнатович H.B. и др.).
57. Bioindication on cellular cultures of human and animals organs at ecological researches // 10-th International Congress on Circumpolar Health. - Ancorage, Alaska, U.SA. - May 9 - 24, 1996.-P. 5-7.
58. Применение антиоксидантов и антигипоксантов в комплексе терапии и профилактики язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки // Метод, реком. - Новосибирск, 1996. - С. 1 - 3 (соавт. Куликов В.Ю., Сафронов ИД.).
59. Применение антиокевдантов в комплексной терапии и профилактике заболеваний органов дыхания в районах Крайнего Севера // Метод, реком. - Новосибирск, 1996. - 3 с. (соавт. Куликов В.Ю., Сафронов И.Д.).
Соискатель!/ //, ...ул. I Л.П.Михайлова
В развитии низших и высших позвоночных отчетливо прослеживается единая общебиологическая закономерность, выражающаяся в появлении зародышевых листков и обособлении основных зачатков органов и тканей. Процесс образования тканей из материала эмбриональных зачатков составляет суть учения о гистогенезах.
Эмбриональный гистогенез , по определению А.А. Клишова (1984), - это комплекс координированных во времени и пространстве процессов пролиферации, клеточного роста, миграции, межклеточных взаимодействий, дифференциации, детерминации, программированной гибели клеток и некоторых других. Все названные процессы в той или иной мере протекают в зародыше, начиная с самых ранних стадий его развития.
Пролиферация . Основной способ деления тканевых клеток - это митоз. По мере увеличения числа клеток возникают клеточные группы, или популяции, объединенные общностью локализации в составе зародышевых листков (эмбриональных зачатков) и обладающие сходными гистогенетическими потенциями. Клеточный цикл регулируется многочисленными вне- и внутриклеточными механизмами. К внеклеточным относятся влияния на клетку цитокинов, факторов роста, гормональных и нейрогенных стимулов. Роль внутриклеточных регуляторов играют специфические белки цитоплазмы. В течение каждого клеточного цикла существуют несколько критических точек, соответствующих переходу клетки из одного периода цикла в другой. При нарушении внутренней системы контроля клетка под влиянием собственных факторов регуляции элиминируется апоптозом, либо на некоторое время задерживается в одном из периодов цикла.
Метод радиографического анализа клеточных циклов в различных тканях выявил особенности соотношения клеточной репродукции и дифференцировки. Например, если в тканях (кроветворные ткани, эпидермис) имеется постоянный фонд пролиферирующих клеток, за счет которых обеспечивается непрерывное возникновение новых клеток взамен погибающих, то эти ткани относятся к обновляющимся. Другие ткани, например, некоторые соединительные, характеризуются тем, что в них увеличение количества клеток происходит параллельно с их дифференцировкой, клетки в этих тканях характеризуются низкой митотической активностью. Это растущие ткани. Наконец, нервная ткань характеризуется тем, что все основные процессы репродукции заканчиваются в период эмбрионального гистогенеза (когда формируется основной запас стволовых клеток, достаточный для последующего развития ткани). Поэтому она отнесена к стабильным (стационарным) тканям. Продолжительность жизни клеток в обновляющихся, растущих и стабильных тканях разная.
Наряду с обновлением клеточной популяции , в самих клетках постоянно наблюдается обновление внутриклеточных структур (внутриклеточная физиологическая регенерация).
Клеточный рост, миграция и межклеточные взаимодействия . Рост клеток проявляется в изменении их размеров и формы. При усилении функциональной активности и внутриклеточных биосинтезов наблюдается увеличение объема клетки. Если объем клетки превышает некую норму, то говорят о ее гипертрофии, и наоборот, при снижении функциональной активности происходит уменьшение объема клетки, а при переходе некоторых нормативных параметров возникает атрофия клетки. Рост клетки не беспределен и определяется оптимальным ядерно-цитоплазменным отношением.
Важное значение для гистогенеза имеют процессы перемещения клеток . Миграция клеток наиболее характерна для периода гаструляции. Однако и в период гисто- и органогенеза происходят перемещения клеточных масс (например, смещения миобластов из миотомов в места закладки скелетных мышц; движение клеток из нервного гребня с образованием спинномозговых ганглиев и нервных сплетений, миграция гоноцитов и т. д.). Миграция осуществляется с помощью нескольких механизмов. Так, различают хемотаксис - движение клеток в направлении градиента концентрации какого-либо химического агента (перемещения спермиев к яйцеклетке, предшественников Т-лимфоцитов из костного мозга в закладку тимуса).
Гаптотаксис - механизм перемещения клеток по градиенту концентрации адгезионной молекулы (движение клеток протока пронефроса у амфибий по градиенту щелочной фосфатазы на поверхности мезодермы). Контактное ориентирование - когда в какой-либо преграде остается один канал для перемещения (описан у рыб при образовании плавников).
Контактное ингибирование - этот способ перемещения наблюдается у клеток нервного гребня. Суть способа заключается в том, что при образовании ламеллоподии одной клеткой и контакта ее с другой клеткой, ламеллоподия прекращает рост и постепенно исчезает, но в другой части мигрирующей клетки при этом формируется новая ламеллоподия.
В процессе миграции клеток важную роль играют межклеточные взаимодействия. Существует несколько механизмов такого взаимодействия (контактного и дистантного). Выделяется большая группа молекул клеточной адгезии (МКА). Так, кадгерины - это Са2+-зависимые МКА, отвечают за межклеточные контакты при образовании тканей, за формообразование и др. В молекуле кадгерина различают внеклеточный, трансмембранный и внутриклеточный домены. Например, внеклеточный домен ответственен за адгезию клеток с одинаковыми кадгеринами, а внутриклеточный - за форму клетки. Другой класс МКА - это иммуноглобулиновое суперсемейство Са2+-независимых МКА, обеспечивающих, например, адгезию аксонов к сарколемме мышечных волокон, или миграцию нейробластов вдоль радиальных глиоцитов в закладке коры большого мозга и др. Следующий класс МКА - это мембранные ферменты - гликозилтранферазы. Последние по типу "ключ-замок" соединяются с углеводными субстратами - гликозаминогликанами надмембранного комплекса клетки, осуществляя таким образом прочное сцепление клеток.
Кроме механизмов межклеточного взаимодействия , существуют механизмы взаимодействия клеток с субстратом. Они включают формирование рецепторов клетки к молекулам внеклеточного матрикса. К последним относят производные клеток, среди которых наиболее изученными адгезионными молекулами являются коллаген, фибронектин, ламинин, тенасцин и некоторые другие. Коллагены, среди которых различают несколько десятков типов, входят в состав межклеточного вещества рыхлой волокнистой соединительной ткани, базальной мембраны и пр. Фибронектин, секретируемый клетками, является связывающей молекулой между мигрирующей клеткой и межклеточным матриксом. Ламинин - компонент базальной мембраны, также связывает мигрирующие клетки с межклеточным матриксом (справедливо по отношению к эпителиоцитам и нейробластам).
Для осуществления связи мигрирующих клеток с межклеточным матриксом клетки формируют специфические рецепторы. К ним относятся, например, синдекан, который обеспечивает контакт эпителиоцита с базальной мембраной за счет сцепления с молекулами фибронектина и коллагена. Интегрины клеточных поверхностей связывают с внеклеточной стороны молекулы внеклеточного матрикса, а внутри клетки - белки цитоскелета (например, актиновые микрофиламенты). Так возникает связь внутри- и внеклеточных структур, что позволяет клетке использовать для перемещения собственный сократительный аппарат. Наконец, существует большая группа молекул, формирующих клеточные контакты, осуществляющие коммуникацию между клетками (щелевые контакты), механическую связь (десмосомы, плотные контакты).
Дистантные межклеточные взаимодействия осуществляются путем секреции гормонов и факторов роста (ФР). Последние - это вещества, оказывающие стимулирующее влияние на пролиферацию и дифференцировку клеток и тканей. К ним относятся, например, ФР, полученный из тромбоцитов и влияющий на переход клеток в фазу размножения (гладких миоцитов, фибробластов, глиоцитов); эпидермальный ФР - стимулирует пролиферацию эпителиоцитов, производных эктодермы; ФР фибробластов - стимулирует пролиферацию фибробластов. Особо выделяется большая группа пептидов (соматотропины, соматомедины, инсулин, лактоген), влияющих на развитие клеток плода.
Механизмы оплодотворения
Процесс оплодотворения у животных можно разделить на три фазы. Первая фаза характеризуется сближением сперматозоида с яйцеклеткой до их контакта. В эту фазу осуществляются дистантные взаимодействия между половыми клетками. Вторая фаза начинается с того, что сперматозоид прикрепляется к поверхности яйцеклетки. В это время наблюдаются контактные взаимодействия между половыми клетками. Третья фаза процесса оплодотворения начинается после проникновения сперматозоида в яйцо и завершается объединением ядер мужской и женской половых клеток. Эта фаза характеризует взаимодействие внутри яйца.
Дистантные взаимодействия между половыми клетками
Дистантные взаимодействия обеспечиваются рядом неспецифических факторов, среди которых особое место принадлежит химическим веществам, которые вырабатываются половыми клетками. Известно, что половые клетки выделяют гамоны или гормоны гамет. Гамоны, которые вырабатываются яйцеклетками, называют гиногамонами, а спрематозоидами - андрогамонами. Женские половые клетки выделяют две группы гамонов: гиногамоны I и гиногамоны II, оказывающие влияние на физиологию мужских половых клеток. Сперматозоиды вырабатывают андрогамоны I и II.
Некоторые из этих химических веществ направлены на повышение вероятности встречи сперматозоида с яйцеклеткой. Известно, что движение сперматозоида к яйцу осуществляется через посредство хемотаксиса - движение сперматозоидов по градиенту концентрации некоторых химических веществ, выделяемых яйцеклеткой. Хемотаксис достоверно показан для многих групп животных, особенно беспозвоночных: моллюсков, иглокожих и полухордовых. Хемотактические факторы выделены из яйцеклеток морских ежей: у одних видов - это пептид, состоящий из десяти аминокислот, и назван сперактом, у других видов - пептид состоит из четырнадцати аминокислот и, получил название резакт. При добавлении экстрактов этих веществ в морскую воду, сперматозоиды соответствующего вида начинают двигаться вверх по градиенту их концентрации.
В движении сперматозоидов млекопитающих по верхним отделам яйцевода существенное значение имеет явление реотаксиса - способность двигаться против встречного течения жидкости яйцевода.
После того, как сперматозоид пройдет сквозь защитные оболочки яйца и вступит в контакт с его плазматической мембраной, начинаются контактные взаимодействия между половыми клетками, которые приведут к проникновению сперматозоида в цитоплазму яйца.
Контактные взаимодействия между половыми клетками
Контакт сперматозоида с мембраной яйцеклетки приводит к активации половых клеток. Реакция активации связана со сложными морфологическими, биохимическими и физико-химическими изменениями в половых клетках. Активация мужской половой клетки, в первую очередь связана с акросомной реакцией, а женской - с кортикальной реакцией.
Акросомная реакция характеризуется быстрыми изменениями в акросомном аппарате головки сперматозоида, сопровождающимися высвобождением заключенных в ней спермолизинов и выбрасыванием акросомной нити в сторону поверхности яйца.
Рассмотрим общую схему акросомной реакции у представителей разных групп морских беспозвоночных - иглокожих, кольчатых червей, двустворчатых моллюсков, кишечно-дышащих и др.
На вершине головки сперматозоида, плазматическая мембрана и, прилежащая к ней часть мембраны акросомного пузырька, растворяются (лизируются). Свободные края обеих мембран сливаются между собой в единую мембрану. Из обнажившейся акросомы выходят спермолизины в окружающую среду и приводят к растворению яйцевых оболочек в месте контакта со сперматозоидом. После этого внутренняя мембрана акросмного аппарата выпячивается наружу и образует вырост в виде трубочки (акросомная нить). Акросомная нить удлиняется, проходит через разрыхленную область дополнительных яйцевых оболочек и вступает в контакт, с плазматической мембраной яйцеклетки. В области контакта акросомной нити с поверхностью яйца плазматические мембраны сливаются и содержимое акросомной трубочки (нити) соединяется с цитоплазмой яйцеклетки. В результате слияния мембран образуется цитоплазматический мостик. Чуть позже по цитоплазматическому мостику в цитоплазму яйца перейдут ядро и центриоль сперматозоида. Акросомная реакция завершается встраиванием мембраны сперматозоида в мембрану яйцеклетки. С этого момента сперматозоид и яйцеклетка являются уже единой клеткой (Рис.7, 8, 9.).
Рис.7. Акросомная реакция сперматозоида: А - В - слияние наружной мембраны акросомы и мембранысперматозоида. Излияние содержимого акросомного пузырька; 1 - мембрана акросомы; 2 - мембрана сперматозоида; 3 - глобулярный актин; 4 - ферменты акросомы; Г - Д - полимеризация актина и образование акросомного выроста; 5 - биндин; 6 - вырост акросомы; 7 - актиновые микрофиломенты; 8 - ядро сперматозоида. (по Голиченкову)
При общем сходстве акросомной реакции, у этих животных между ними имеются и определенные различия. Так, у иглокожих в отличие у червей и моллюсков в акросомном аппарате не содержатся литические ферменты. У большинства изученных животных образуется одна акросомная нить, а у некоторых червей - несколько таких нитей.
Рис.8. Последовательность акросомной реакции у морского ежа. (по Голиченкову)
При оплодотворении у позвоночных животных также происходит акросомная реакция. У низших позвоночных (миноги, и осетровые рыбы), она во многом сходна с акрсомной реакцией спермиев беспозвоночных животных.
Рис.9. Схема процессов, происходящих при взаимодействии мембран яйцеклетки и сперматозоида в ходе оплодотворения (по Гилберт).
У акуловых рыб, рептилий и птиц, яйца которых одеты плотными оболочками, соединение гамет происходит раньше, чем эти оболочки сформируются. У этих животных акросома продолжает выполнять свою первоначальную роль и, хорошо развита.
Акросомная реакция у млекопитающих отличается от такой реакции у ьеспозвоночных и низших позвоночных. В спермии млекопитающих акросомная реакция протекает без образования акросомного выроста, Приблизившись к поверхности яйца, спермий сливается с его плазматической мембраной боковой поверхностью головки.
У насекомых и высших рыб соединение половых клеток происходит после того, как полностью образуются плотные дополнительные яйцевые оболочки. В этих случаях сперматозоид проникает в яйцо через микропиллярные каналы и соединение гамет происходит без участия акросомы.
Активация яйца. Кортикальная реакция. После того, как мужская половая клетка прикрепится к поверхности яйца и ее акросомная нить вступит в контакт с поверхностью ооплазмы, происходит активация яйцеклетки. Активация яйца связана со сложными изменениями самых разных сторон его деятельности. Наиболее ярким внешним проявлением активации являются изменения поверхностного слоя ооплазмы, получившие название кортикальной реакции (Рис. 10).
Рис.10. Кортикальная реакция в яйце морского ежа А-приближение спермия к яйцу; Б-Г-последовательные стадии кортикальной реакции; показаны волна выделения содержимого кортикальных гранул, распространяющаяся от места проникновения спермия, отделение оболочки и образование перивителлинового пространства, формирование гиалтнового слоя; гс-гиалиновый слой; жо-желточная о болочка кг-кортикальная гранула; оо-оболочка оплодотворения пм-плазматическая мембрана; пп-перивителлиновое пространство, заполненное перивителлиновой жидкостью (по Гинзбург).
Рассмотрим последовательные стадии кортикальной реакции на примере наиболее полно, изученных яйцеклеток морского ежа. Кортикальная реакция начинается с того, что мембрана, ограничивающая каждую кортикальную гранулу, слипается с плазматической мембраной яйца. В этом месте гранулы открываются, и их содержимое изливается в желточную оболочку. Процесс секреции содержимого кортикальных гранул начинается от места прикрепления сперматозоида и волнообразно распространяется во все стороны до тех пор, пока не охватит всю поверхность яйца. Часть выделенного содержимого кортикальных гранул оводняется и растворяется, образуя перивителлиновую жидкость, которая оттесняет желточную оболочку от плазмолеммы яйца, приводя к увеличению объема перивителлинового пространства. Другая часть содержимого кортикальных гранул сливается с желточной оболочкой, которая при этом утолщается и преобразуется в оболочку оплодотворения. Часть кортикальных гранул, не участвующих в образовании оболочки оплодотворения, превращаются в плотный слой, называемый гиалиновым слоем, расположенным над плазматической мембраной. После того, как сформируется оболочка оплодотворения, другие сперматозоиды лишаются возможности проникнуть в ооплазму яйца.
В последние годы был изучен химический состав содержимого кортикальных гранул. Показано, что содержимое кортикальных гранул содержит следующие вещества: а) протеолитический фермент (актеллиновая деламиназа), разрывающий связи между клеточной оболочкой и плазматической мембраной яйца; б) протеолетический фермент (сперм-рецепторная гидролаза), который освобождает осевшую на желточной оболочке сперму; в) гликопротеид, втягивающий воду в пространство между желточной оболочкой и плазматической мембраной, вызывая их расслоение; г) фактор, способствующий образованию оболочки оплодотворения; д) структурный белок гиалин, участвующий в образовании гиалинового слоя.
Каково биологическое значение кортикальной реакции?
Во-первых, кортикальная реакция является тем механизмом, который защищает яйцо от проникновения сверхчисленных сперматозоидов.
Во-вторых, образующаяся в результате кортикальной реакции перивителлиновая жидкость, служит специфической средой, в которой протекает развитие зародыша.
При активации яйца наблюдаются и другие изменения самых разных сторон его деятельности.
Во-первых, снижается тормоз, который блокировал мейоз и, ядерные преобразования продолжаются с той самой стадии, на которой они остановились к моменту выхода яйца из яичника.
Во-вторых, наблюдается серия биохимических изменений, сопровождаемых усилением углеводного обмена, повышением синтеза липидов и белков.
В-третьих, резко возрастает проницаемость клеточной мембраны для ионов натрия и калия.
События, происходящие в яйце после проникновения сперматозоида
После того, как плазматическая мембрана акросомной нити спермия сливается с плазматической мембраной яйца, спермий утрачивает свою подвижность и его вовлечение внутрь яйца происходит благодаря действию сил, исходящих из активированного яйца. Обычно сперматозоид втягивается в ооплазму вместе с хвостом, но иногда хвостовой отдел отбрасывается. Однако и в тех случаях, когда жгутик проникает в яйцо, он отбрасывается и рассасывается.
Высоко-конденсированное ядро сперматозоида начинает набухать, хроматин разрыхляется и ядро превращается в своеобразную структуру, называемым мужским пронуклеусом.
Аналогичные изменения происходят и в ядре яйцеклетки, в результате чего образуется женский пронуклеус. В период формирования пронуклеусов, вдоль хромосом происходит репликация ДНК. В дальнейшем пронуклеусы начинают перемещаться к центру яйцеклетки. Ядерные оболочки, окружающие каждого из пронуклеусов разрушаются, пронуклеусы сближаются и происходит кариогамия. Кариогамия - это последняя стадия оплодотворения. При объединении пронуклеусов образуется ядро с диплоидным набором хромосом. Затем хромосомы занимают экваториальное положение, и наступает первое деление зиготы.
Ооплазматическая сегрегация. После проникновения сперматозоида начинаются интенсивные перемещения цитоплазмы яйцеклетки (ооплазмы). При этом происходит расслоение, отмешивание различных составных частей ооплазмы, что обозначается как ооплазматическая сегрегация. В ходе этого процесса намечаются основные элементы пространственной организации зародыша. Поэтому данный этап развития называют также проморфогенезом: имеется в виду, что в это время как бы расставляются вехи для будущих морфогенетических процессов.
Моно- и полиспермия
Проникновение в яйцеклетку одного сперматозоида, получило название, физиологической моноспермии. Моноспермия присуща всем группам животных с наружным осеменением и многим животным с внутренним осеменением (тем, которые подобно, млекопитающим имеют яйцеклетки небольшого размера).
У других животных, например, у некоторых членистоногих (насекомые), моллюсков (класс брюхоногих), хордовых (акулообразные рыбы, хвостатые амфибии, рептилии и птицы) в яйцеклетку проникает большое количество сперматозоидов. Такое явление получило название физиологической полиспермии. Однако и в этом случае с ядром яйцеклетки соединяется только ядро одного сперматозоида, тогда как остальные разрушаются (рис.11).
Рис. 11. Полиспермия у тритона. А-проникновение спермиев в яйцо на стадии метафазы II деления созревания; Б-синхронные изменения семенных ядер, образование семенных звезд; В-женское ядро соединяется с одним из семенных ядер; Г - Е-синкарион вступает в митоз, сверхчисленные семенные ядра оттесняются в вегетативное полушарие и дегенерируют. Цифры над изображением яиц - время после проникновения спермиев при температуре 23 о (по Гинзбург).
При физиологической моноспермии имеются особые механизмы защиты яйца от полиспермии. Первый механизм связан с изменением мембранного потенциала. Установлено, что в яйцеклетке лягушки, через несколько секунд, после контакта со сперматозоидом заряд мембраны изменяется от -28 до 8 мв и остается положительным в течение 20 мин. Такие же изменения мембранного потенциала были обнаружены в яйцеклетках морского ежа. Оказалось, что положительный заряд мембраны препятствует полиспермии. Другой широко распространенный механизм защиты яйца от проникновения сверхчисленных сперматозоидов связан с образованием оболочки оплодотворения и перивителлиновой жидкости.
