Стадии апоптоза. Механизм апоптоза

Термин"апоптоз", предложенный в 1972 г. английскими учеными J.F.R. Кеrr, А.Н. Wyllie и A.R. Currie, состоит из двух греческих слов и означает в буквальном смысле "отделение лепестков от цветов", а применимо к клетке - особый тип смерти путем разделения ее на части (" апоптозные тельца "), которые впоследствии фагоцитируются соседними клетками разного типа.

Термин "программированная клеточная смерть" отражает функциональное назначение этого процесса, представляющего естественную часть жизни многоклеточного организма, связанного с метаморфозом и развитием [ Hedgecock E.M., Salston J.E. 1983 , Oppenheim R.W. 1991 ].

В генетическом аппарате многоклеточных организмов - животных, растений и грибов заложена программа гибели клеток. Это специальная программа, которая при определенных обстоятельствах может привести клетку к гибели. При нормальном развитии эта программа направлена на удаление избыточно образовавшихся клеток -"безработных", а также клеток -"пенсионеров", переставших заниматься общественно полезным трудом. Другая важная функция клеточной гибели - удаление клеток -"инвалидов" и клеток- "диссидентов" с серьезными нарушениями структуры или функции генетического аппарата. В частности, апоптоз - один из основных механизмов самопрофилактики онкологических заболеваний [ Thompson ea 1995 ].

Апоптоз играет главную роль как в развитии так и в гомеостазе [ Steller ea 1997 ]. Клетки умирают от апоптоза в развивающемся эмбрионе в ходе морфогенеза или синантогенеза и во взрослых животных в ходе обновления тканей. Система программируемой клеточной смерти - существенный фактор иммунитета , поскольку гибель зараженной клетки может предотвратить распространение инфекции по организму. Формообразовательные процессы в онтогенезе, позитивная и негативная селекция Т- и В-лимфоцитов у животных, гипер-чувствительный ответ растений на вторжение патогена, осенний листопад - лишь несколько примеров программируемой клеточной смерти (апоптоза).

Определенные клетки организма обладают уникальными сенсорами, называемыми рецепторами смерти , расположенными на поверхности клеток. Рецепторы смерти детектируют присутствие межклеточных сигналов смерти и в ответ на это быстро запускают внутриклеточный механизм апоптоза.

Поскольку физиологическая роль апоптоза очень существенна, нарушения этого процесса могут быть весьма вредными. Так, несвоевременный апоптоз определенных мозговых нейронов оказывает влияние на образование нарушений, таких как болезни Альтцгеймера и Паркинсона , в то время как неспособность делящихся клеток перейти к апоптозу после случившихся существенных нарушений ДНК способствует развитию рака.

Другим механизмом, направленным на подавление апоптоза, является активация транскрипционного фактора NF-кВ . Известен целый ряд антиапоптозных белков, кодируемых генами, экспрессия которых возрастает под действием NF-кВ, что приводит к предотвращению гибели клетки [ O"Connor et al., 2000 ]. Таким образом, регуляция апоптоза представляет собой пример сбалансированного механизма с многократным дублированием противовесов, призванным обеспечить надежный контроль за реализацией столь важной для клетки программы и в то же время делающим ее очень зависимой от внешних и внутренних воздействий.

В развитии апоптоза выделяют 3 морфологичеси различимых стадии: сигнальную (индукторную), эффекторную и деградации (деструкции). Индукторами апоптоза могут быть как внешние (внеклеточные) факторы, так и внутриклеточные сигналы. Сигнал воспринимается рецептором и далее последовательно передается молекулам-посредникам (мессенджерам) различного порядка и достигает ядра, где происходит включение программы клеточного "самоубийства" путем активации летальных и/или репрессии антилетальных генов. В ядре регистрируются первые морфологические признаки апоптоза - конденсация хроматина с формированием его осмиофильных скоплений, прилежащих к ядерной мембране. Позже появляются инвагинации (вдавления) ядерной мембраны, и происходит фрагментация ядра. В основе деградации хроматина лежит ферментативное расщепление ДНК [ Arends ea 1990 , Wyllie ea 1980 ]. Сначала образуются фрагменты, включающие 700, 200-250, 50-70 тыс. пар оснований, затем - фрагменты, содержащие 30-50 тыс. пар оснований. После реализации этого этапа процесс становится необратимым. Затем наступает межнуклеосомная дезинтеграция ДНК, т.е. разрывы нитей ДНК, находящихся между нуклеосомами. При этом образуются фрагменты, кратные по величине 180-190 пар оснований, что соответствует протяженности нити ДНК в пределах одной нуклеосомы. Отделившиеся фрагменты ядра, ограниченные мембраной, называют апоптотическими тельцами. В цитоплазме происходит расширение эндоплазматического ретикулума, конденсация и сморщивание гранул. Важнейшим признаком апоптоза является снижение трансмембранного потенциала митохондрий и выход в цитоплазму различных апоптогенных факторов (цитохрома с; прокаспаз 2, 3, 9; апоптоз-индуцирующего фактора). Именно нарушению барьерной функции митохондриальных мембран отводят ключевую роль в развитии многих типов апоптоза. Клеточная мембрана утрачивает ворсинчатость и образует пузыревидные вздутия. Клетки округляются и отделяются от субстрата. На поверхности клетки экспрессируются различные молекулы, распознаваемые фагоцитами - фосфосерин, тромбоспондин, десиалированные мембранные гликоконъюгаты, в результате чего происходит поглощение тела клетки другими клетками и его деградация в окружении лизосом фагоцитарных клеток [

УДК 61 1.018.1:611.013.1 1:618.32-091.8

АПОПТОЗ: ПОНЯТИЕ, МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ, ЗНАЧЕНИЕ*

© 2006 г. О. Ю. Варга, В. А. Рябков

Государственный университет, г. Петрозаводск

В статье дано понятие апоптоза, программированной клеточной гибели, изложены современные представления о механизмах реализации - пути «рецепторов смерти», характерном для физиологических процессов, и митохондриальном пути активации апоптоза, характерном для патологических процессов, основных участниках, роли эндоплазматичес-кого ретикулума, значении апоптоза для биологии и медицины.

Ключевые слова: апоптоз, программированная клеточная гибель, цитокины, каспазы, путь «рецепторов смерти», митохондриальный путь.

Апоптоз (А) представляет собой особую, генетически запрограммированную, форму гибели клетки и является необходимым условием нормального существования организма. Назначение А состоит в поддержании постоянства численности клеток, обеспечении правильного соотношения клеток различных типов и удалении генетически дефектных клеток. Клетки, подвергающиеся такой программированной смерти, активно используют генетически контролируемую программу, нацеленную на собственную гибель, совершая тем самым своего рода суицид. Гибель клеток происходит в пользу сообщества, следовательно, можно говорить о социальном поведении клетки. Без сомнения, А - способ очистки клеточной популяции от ненужных или нежелательных клеток.

Со времени введения термина «апоптоз» J. Kerr в 1972 году интерес к процессу физиологической гибели клеток неуклонно растет, что связано с выявляемыми его нарушениями в ряде патологических состояний, в том числе при аутоиммунных и онкологических заболеваниях .

Процесс А характеризуется определенными особенностями морфологии - ядро и цитоплазма уменьшаются в размерах, конденсируются, фрагментируются, клетка распадается на несколько частей (апоптотические тельца), содержащих элементы ядра и интактные органеллы . Ядро подвергается разрушению через образование крупных фрагментов с последующей их межнуклеосомной деградацией. Плазматическая мембрана клетки претерпевает ряд изменений, делающих ее узнаваемой для фагоцитов, в результате чего апоптотические тельца быстро поглощаются макрофагами, а также нередко и окружающими клетками, не специализирующимися в фагоцитозе .

Таким образом, структурная целостность биологических мембран в ходе А не нарушается, что предупреждает выход содержимого цитоплазмы (в том числе лизосомальных ферментов) во внеклеточную среду и развитие воспаления . Поэтому процесс А, как правило, происходит без макроскопических признаков, структурных и функциональных дефектов ткани и без развития воспаления .

В отличие от А некроз характеризуется увеличением проницаемости мембран вследствие нарушения их структуры, повреждением органелл, разрывом плазматической мембраны и финальным клеточным лизисом с выходом цитозоля в экстрацеллюлярное пространство и развитием воспалительного процесса .

* Работа поддержана грантом Президента Российской Федерации № МК-1814.2004.7.

Механизмы апоптоза

Условно весь процесс А может быть разделен на две фазы: формирование и проведение апоптотических сигналов и демонтаж клеточных структур .

Пути, которыми достигается конечная цель А - гибель клетки, различны и включают сложное взаимодействие большой группы веществ, центральное место среди которых занимают особые протеа-зы - каспазы (caspases, Cytosolic Aspartate-Specific cysteine Proteases). Каспазы (К) представляют собой аспартат-специфические протеазы, расщепляющие белки в местах расположения аспарагиновых оснований . Эти соединения расположены в цитоплазме в неактивном состоянии для исключения возможности случайной гибели клетки .

Каспазы состоят из трех доменов: N-концевого домена; большой субъединицы; малой субъединицы. Активация К происходит путем протеолитического отщепления N-концевого домена с ассоциированием субъединиц в гетеродимер и формированием активного центра .

По своим функциональным обязанностям и структурной гомологии К подразделяются на три группы: активаторы цитокинов (К 1, 4, 5, 13); индукторы активации эффекторных К (К 2, 8, 9, 10); эффекторные К - исполнители А (К 3, 6, 7) .

Основные направления разрушительного действия К на клетку:

1. Инактивация ингибиторов апоптотических белков: CAD (каспазактивированная ДНК-аза) соединена с белком-ингибитором IСАD; активированные К 3 и 7 разрушают белок ICAD, запуская действие ДНК-азы .

2. Прямое расщепление структурных белков клетки: ядерный ламин - белок, жестко связанный с ядерной мембраной и организующий структуру хроматина; активированная К 6 расщепляет ламин, приводя к конденсации хроматина .

3. Нарушение регуляции белкового синтеза: гелсо-лин регулирует натяжение нитей актина; эффекторные К расщепляют гелсолин, нарушая цитоскелет .

4. Инактивация белков, вовлеченных в репарацию ДНК, образование мРНК, репликацию ДНК .

Принято выделять два принципиально различных механизма активации К: путь «рецепторов смерти», расположенных на поверхности клетки, характерен для неповрежденных клеток; митохондриальный путь, опосредованный семейством белков Bcl-2, характерен для патологически измененных клеток .

Механизм регуляции с помощью цитокинов

(путь «рецепторов смерти»)

Цитокины - группа белков, которые посредством связывания со специфическими рецепторами на клетках-мишенях регулируют их пролиферацию и дифференцировку. Процесс А запускается в момент взаимодействия специфического рецептора и его лиганда - экстрацеллюлярного белка смерти (TNF-a, FasL, TRAIL, Apo-3L) . Наиболее изученным из

индукторов клеточной гибели является Fas-лиганд (FasL) - цитокин семейства фактора некроза опухолей с молекулярной массой 37кД, вызывающий при взаимодействии со специфическим рецептором Fas^PO/CD95 А клетки. FasL экспрессируется на активированных Т-лимфоцитах и НК-клетках. В тес-тикулах и тканях глаза FasL обеспечивает защиту от иммунного повреждения собственных клеток .

Fas представляет собой гликозилированный поверхностный белок мембраны клеток с молекулярной массой 48кД, который экспрессируется на поверхности активированных Т- и В-лимфоцитов, клетках различных опухолей, некоторых нормальных клетках человека . Fas также встречается в растворимой форме (sFas), которая лишена трансмембранного участка.

При связывании FasL с тремя молекулами Fas привлекается FADD (Fas associated death domain, связанный с Fas «регион клеточной смерти»), который одним концом связан с DD (death domain, «регион смерти»), относящимся непосредственно к рецептору, а другим (N-терминальный регион, DED (death effector domain, «регион исполнителя смерти»)) взаимодействует с прокаспазой (проК 8 или проК 10), вызывая ее аутокаталитическую активацию . Таким образом формируется DISC (индуцирующий смерть сигнальный комплекс) , включающий в себя DD, FADD, DED, проК 8.

Итогом формирования DISC является активация специфической протеазы - К 8 (FLICE), обеспечивающей процесс А. Активная К 8 запускает А двумя путями:

Каспаза 8 активирует проК 3 (при достаточном количестве К 8 в DISC): К 3 способна к аутокатализу; К 3 активирует другие эффекторные К; К 3 активирует фактор фрагментации ДНК

Специфическую ДНКазу (CAD/DFF40).

Каспаза 8 расщепляет белок Bid семейства Bcl-2 (как обходной путь, необходимый при низком уровне К 8 в DISC): выделяется митохондриальный цитохром С (специфический инициирующий фактор); цитохром С взаимодействует с APAF-1 (apoptotic protease activating factor - апоптотический протеаза-активирующий фактор) и проК 9 через CARDs (caspase recruitment domains); формируется комплекс - апоптосома; апоптосома приводит к активации К 9; через К 9 происходит активация эффекторных К 3, 6, 7 .

Как уже упоминалось, помимо системы Fas/FasL существуют другие, влияющие на А. В настоящее время известно еще 4 специфических рецептора к белкам смерти (рецепторы смерти): TNFR1; DR3 (TRAMP, Apo-3, Wsl-1); DR-4 (TRAIL-R1); DR5 (TRAIL-R2) . Соответствующими лигандами будут являться TNF-a, Apo-3L, TRAIL, при этом DR3 является TNFR-ассоциированным доменом белка TRADD, тогда как Fas и DR4 взаимодействуют с Fas-ассоциированным доменом белка FADD .

Следует отметить, что пути активации А, включаемые адаптером TRADD через проК 8, конкурируют с параллельными путями подавления клеточной гибели, что может объяснять данные о различном влиянии TNF-a на А . В частности, подавление А, опосредованное рецептором TNF-R1, идет следующим образом: TNF-R1 через DD домен белка TRADD (TNF receptor-1-associated death domain) и белка, взаимодействующего с рецептором (RIP, receptor interacting protein) связывается с TRAF2 (TNF receptor associated factor); TRAF2 вызывает фосфорилирование белка-ингибитора, с которым связан NF-kB; NF-kB перемещается в ядро, где активирует гены, отвечающие в том числе за экспрессию антиапоптозных молекул.

Несмотря на то, что наиболее часто NF-kB рассматривается как ингибитор А, в некоторых клетках это соединение может выступать в качестве индуктора . Подобное его свойство объясняют регуляцией экспрессии широкого ряда активных веществ (про-воспалительных энзимов, цитокинов, хемокинов, иммунорецепторов, клеточных молекул адгезии) через прикрепление к определенным областям ДНК (kB-области). В частности, NF-kB способен активировать гены, кодирующие Fas и FasL, что может сенситизировать клетки .

В связи с вышесказанным важно отметить способность ряда НПВП (салицилаты) ингибировать активность NF-kB, приводимую в качестве объяснения их противоопухолевой активности (заболевания толстой кишки). При этом салицилаты блокируют NF-kB в достаточно больших дозах, превышающих противовоспалительные и способных оказывать токсический эффект . Указанное свойство среди всей группы НПВП носит неоднородный характер.

Помимо перечисленных соединений, индуцирующих А, в клетках существует механизм негативной регуляции этого процесса - эндогенные ингибиторы К (белки семьи IAP), подавляющие активность К 3 и 9 и структурные гомологи проксимальных К 8 и 10. К последним относится клеточный протеин, известный как FLIP (Flame, CASH, Casper, Clarp, MRIT, I-Flice or Usurpin), который способен угнетать активацию К 8 и 10 путем конкуренции за связь с FADD . Известно об образовании двух вариантов FLIP, один из которых по размерам меньше (FLIPS) другого (FLIPl). Общим свойством обоих FLIP является наличие в структуре DED, который конкурирует с DED проК 8 за связь с FADD. Прочие особенности строения определяют конечный результат: только FLIPS и очень высокий уровень FLIPl ингибируют А, индуцированный рецепторами смерти, в то время как низкий уровень FLIPl обеспечивает активацию К 8 .

Отдельно рассматривается группа ингибиторов мембранорецепторного А - ложных рецепторов (decoy receptors), которые схожи по структуре с нормальными апоптозными рецепторами (Fas, TRAIL), но отличаются от них делецией какого-либо домена.

Необратимо связываясь с соответствующими лигандами, они блокируют передачу сигнала к гибели клетки .

Описанный рецепторный путь клеточной гибели является более коротким, чем другой путь - опосредованный митохондриями , но функционально оба они тесно связаны друг с другом.

Семейство Bcl-2 и митохондриальный путь

активации апоптоза

Митохондриальный путь А инициируется повреждением ДНК или воздействием цитотоксических агентов, что характеризует патологически измененные клетки . Важнейшим сенсором повреждения ДНК является ген р53 («страж генома»), который располагается в коротком плече 17 хромосомы, кодирует образование ядерного белка из 393 аминокислот АК (масса 53кД). Белок р53 находится в латентном состоянии и активируется не только в ответ на повреждение ДНК, но и вследствие гипоксии, активации онкогенов или воздействия других цитотоксических агентов . Роль гена р53 в гибели измененной клетки доказывается наличием его мутации примерно в 50 % опухолей человека . При активации р53 помимо прекращения клеточного деления инициирует А несколькими путями: активация генов Вах или Bid ; активация образования свободных форм кислорода (гены группы PIG3 (p-53-induced gene 3)), способствующих выходу цитохрома С из митохондрий ; индуцирует мРНК Fas, а также перемещение Fas на поверхность клетки из аппарата Гольджи ; стимулирует образование APAF-1 ; стимулирует экспрессию К 6 ; переход части молекул самого р53 в митохондрии с последующим выходом цитохрома С (Bcl-2 предотвращал эти эффекты) .

Важнейшим среди перечисленных является включение проапоптотических соединений семейства Bcl-2. Bcl-2 впервые описан как онкоген при В-клеточной лимфоме, приводящий к образованию опухолевого клона за счет увеличения выживаемости опухолевых клеток. В настоящее время семейство Bcl-2 объединяет группу белков (около 20 соединений) со сходным морфологическим составом, в котором существует по крайней мере одна из четырех консервативных аминокислотных последовательностей, характерных для В^2 (BH, Bcl-2 homology domain) . Функциональное значение этих регионов (ВН1-ВН4) пока окончательно не ясно . Семейство белков разделяется на две группы :

Ицдукторы апоптоза: Bim, Bad, Bid - BH-3; «multi-BН domain» (Bax, Bak, Bok) - ВН-1, BH-2, BH-3.

Ингибиторы апоптоза: Bcl-2, Bcl-w, А1 - ВН-1, ВН-2, ВН-3, ВН-4; Mcl-1, Bcl-xL - ВН-1, BH-2, BH-3.

ВН-3 белки являются первичными инициаторами

А, находясь в прямом антагонизме с антиапоптозными соединениями семейства Bcl-2 . Предполагаемые

модели взаимодействия фракций Bcl-2 семейства различны, а решение о гибели клетки принимается на основании относительного преобладания активных супрессоров или промоторов А .

Предполагаемые модели взаимодействия фракций Bcl-2:

1) Bcl-2 секвестрирует BH-3 лиганды Bax/Bak, предупреждая активацию А;

2) ВН-3 белки действуют на Вс1-2 и уменьшают их ингибирующее влияние на Вах;

3) отдельные ВН-3 белки активируют Вах, другие инактивируют Вс1-2 и посредством этого уменьшают ингибирующее влияние на проапоптоти-ческие белки .

Проапоптотические белки группы Bcl-2 имеют СООН-концевой гидрофобный регион, ответственный за прикрепление к мембранам органелл, в том числе к наружной поверхности митохондриальной мембраны в местах сближения наружной и внутренней мембран, где существуют физиологические поры (мегаканалы) (канал для Са, вольтажа, рН, активных форм кислорода), непроходимые в норме для цитохрома С. Белки Bcl-2 (Bax, Bak и др.) временно образуют более крупные мегаканалы, по которым в цитоплазму поступают цитохром С и другие факторы А .

Следствием раскрытия пор может быть и набухание матрикса с растяжением им внутренней митохондриальной мембраны, которая имеет большую поверхностную зону, чем наружная, вследствие чего возникают разрывы наружной мембраны и высвобождается цитохрома С . При всех указанных процессах митохондрия не теряет целостности и не подвергается разрушению.

Цитохром С представляет собой белок с молекулярной массой 15кД, кодируется ядерным геномом, импортируется в митохондрию, где прикрепляется к внутренней поверхности мембраны. Цитохром С необходим для образования апоптосомы, в которой активируется К 9 .

Стрессовый путь А активирует К 9 через комплекс Apaf-1 (apoptic protease activating factor, апоптотический протеаза-активирующий фактор). Конформационные изменения Apaf-1, индуцированные цитохромом С из поврежденных митохондрий и АТФ, позволяют привлечь проК 9 через их общий домен CARDs (caspase recruiment domain) . К 9 апоптосомы, в свою очередь, вызывает активацию эффекторных К (К 3, 7), которые инициируют интенсивный протеолиз и высвобождают связанную ДНКазу (CAD/DFF40), разрушающую хроматин .

К прочим митохондриальным факторам А, расположенным в межмембранном пространстве, относят:

Фактор, индуцирующий А (AIF, apoptosis-induc-ting factor, каспазонезависимая клеточная смерть): активирует нуклеазу, расщепляющую ядерную ДНК ; степень участия требует уточнения (все случаи фрагментации хроматина сопровождались активностью CAD) .

Второй митохондриальный фактор, активирующий А (Diablo/Smac): связывается с ингибиторами белков, активирующих А (IAP).

Термолабильный белок, вызывающий необратимое превращение ксантиндегидрогеназы в ксантинок-сидазу: ксантиндегидрогеназа в норме катализирует NAD + окисление ксантина до гипоксантина и превращение его в мочевую кислоту; ксантиноксидаза обеспечивает подобную реакцию с образованием агрессивных активных форм кислорода.

Особо следует отметить роль белка Bid, который является связующим звеном между двумя путями А - митохондриальным и путем «рецепторов смерти» (при воздействии К 8) .

Эндоплазматический ретикулум и его роль

в апоптозе

В настоящее время эндоплазматический ретикулум (ЭР) рассматривается как участник индуцированного стрессом А, что в значительной мере связывают с ролью ионов кальция. ЭР является самым большим хранилищем ионов кальция в клетке, их выход нередко сопровождается перемещением в митохондрии. Появляются доказательства влияния семейства Bcl-2 на ЭР подобно воздействию на митохондрии, демонстрируется участие Bax и Bak в мобилизации ионов кальция из депо ЭР . Непосредственное влияние обмена ионов кальция на активность К окончательно до настоящего времени не ясно.

На мембране ЭР локализована проК 12, в активации которой также предполагается участие белков семейства Bcl-2. Мышиные клетки с дефицитом К 12 оказались частично резистентными к А, индуцированному ЭР-стрессом, но по-прежнему чувствительными к другим стимулам клеточной гибели. Отмечено опосредованное активирующее влияние К 12 на К 3 .

Другие индукторы апоптоза

Необходимо упомянуть еще один механизм реализации А, происходящий нередко с участием цитоток-сических лейкоцитов. В основе механизма экспозиция на поверхности клетки фосфотидилсерина - фосфолипида, который обычно присутствует только во внутреннем липидном слое плазматической мембраны. Его окисление посредством активных форм кислорода ведет к тому, что особая транспортная АТФаза не узнает фосфолипид и переносит его на внешнюю мембрану. По-видимому, существует специальный рецептор, обнаруживающий фосфатидилсерин в наружном липидном слое и запускающий внутрь клетки сигнал А.

Клетка с фосфатидилсерином во внешнем слое клеточной мембраны узнается лейкоцитами, которые начинают выделять вблизи клетки-мишени белки. Полимеры белка перфорина образуют в цитоплазматической мембране клетки-мишени трансмембранные каналы, через которые внутрь поступают гранзимы (смесь сериновых протеаз) , способные запускать А через превращение проК 3 в К 3.

Кроме того, отмечено, что лейкоциты способны посредством специальной трансмембранной дыхательной цепи плазматической мембраны образовывать супероксиды и бомбардировать ими клетку-мишень, стимулируя А, в том числе через окисление фосфатидилсерина плазматической мембраны клетки-мишени.

Значение апоптоза в патогенезе и лечении

заболеваний

Актуальность изучения проблем А определяется взаимосвязью нарушения регуляции процесса запрограммированной гибели клетки с большинством заболеваний. Так, к заболеваниям, связанным с усилением А, относятся опухолевые заболевания: фолликулярная лимфома, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников, аутоиммунные заболевания: системная красная волчанка, гломерулонефрит, вирусные инфекции, вызванные вирусом герпеса, аденовирусом, поксовирусами. К заболеваниям, ассоциированным с ингибированием А, относятся синдром приобретенного иммунодефицита, нейродегенеративные заболевания: болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, пигментный ретинит, хорея Ген-тингтона, мозжечковые дегенерации, апластическая анемия, токсические заболевания печени .

Изучение механизмов регуляции различных этапов А позволяет определенным образом воздействовать на его отдельные этапы с целью их регуляции или коррекции. В настоящее время общепринято: если клетка погибает от А, подразумевается возможность терапевтического вмешательства, если вследствие некроза - нет. На основе знаний о программированной клеточной гибели используется широкий ряд препаратов с целью регуляции этого процесса в различных типах клеток. Через индукцию А осуществляется действие большинства цитотоксических химиопрепаратов, антиметаболитов нуклеиновых кислот, ингибиторов топоизомераз. С использованием андроген-блокирующей терапии лечат рак предстательной железы. Рак молочной железы часто подвергается регрессии при применении антагонистов эстрогеновых рецепторов .

В ближайшие годы можно ожидать появления новых лекарственных препаратов для лечения и предупреждения различных заболеваний, в основе действия которых будет заложен принцип регуляции процессов А. Многообещающими являются также подходы, связанные с регуляцией апоптоз-специфических генов и реализующиеся, в частности, в генной терапии - одной из самых перспективных областей современной медицины

При лечении заболеваний, вызванных нарушением функционирования отдельных генов.

Список литературы

1. Владимирская Е. Б. Механизмы апоптотической смерти клеток / Е. Б. Владимирская // Гематология и транс-фузиология. - 2002. - Т. 47, № 2. - С. 35-40.

2. Григорьев М. Ю. Апоптоз в норме и патологии / М. Ю. Григорьев, Е. Н. Имянитов, К. П. Хансон //

Медицинский академический журнал. - 2003. - Т. 3, № 3. - С. 3-11.

3. Залесский В. Н. Перспективы патогенетически обоснованного применения модуляторов апоптоза в качестве нейро-, кардио-, гепато- и нефропротекторов (обзор литературы) / В. Н. Залесский, А. А. Фильченков // http://www. medved.kiev.ua/arhiv_mg/st_2001/01_4_16.htm

4. Нагорнев В. А. Апоптоз и его роль в атерогенезе /

В. А. Нагорнев, А. Н. Восканьянц // Медицинский академический журнал. - 2003. - Т. 3, № 4. - С. 3-18.

5. Робинсон М. В. Апоптоз клеток иммунной системы / М. В. Робинсон, В. А. Труфакин // Успехи современной биологии. - 1991. - Т. 3, вып. 2. - С. 246-259.

6. Червякова Н. В. Fas/Fas-лиганд: маркеры апоптоза / Н. В. Червякова // Лаборатория. - 2004. - № 2.

7. Adams J. M. Ways of dying: multiple pathways to apop-tosis / J. M. Adams // Genes and Development. - 2003.

N 17. - P. 2481-2495.

8. Haupt S. Apoptosis - the p53 network / S. Haupt, M. Berger, Z. Goldberg, Y. Haupt // Journal of Cell Science.

2003. - N 116. - P 4077-4085.

9. Highton J. Cell death by apoptosis is a feature of the rheumatoid nodule / J. Highton, P. A. Hessian, A. Kean, M. Chin // Annals of the Rheumatic Diseases. - 2003. - N 62. - P 77-80.

10. Itoh K. Central role of mitochondria and p53 in Fas-mediated apoptosis of rheumatoid synovial fibroblasts / K. Itoh, H. Hase, H. Kojima et al. // Rheumatology. - 2004. - N 43. - P. 277-285.

11. Newton K. Caspases signal not only apoptosis but also antigen-induced activation in cells of the immune system / K. Newton, A. Strasser // Genes and Development. - 2003.

Vol. 17, N 7. - P 819-825.

12. Okamoto K. Fas-associated death domain protein is a Fas-mediated apoptosis modulator in synoviocytes / K. Okamoto, T. Kobayashi, T. Kobata et al. // Rheumatology.

2000. - N. 39 - P. 471-480.

13. Smith M. D. Apoptosis a relevant therapeutic target in rheumatoid arthritis? / M. D. Smith, J. G. Walker // Ibid.

2004. - N 43. - P. 405-407.

14. Smolewska E. Apoptosis of peripheral blood lymphocytes in patients with juvenile idiopathic arthritis / E. Smolewska, H. Brozik, P. Smolewski et al. // Annals of the Rheumatic Diseases. - 2003. - N 62. - P 761-763.

15. Tegeder I. Cyclooxygenase-independent actions of cyclooxygenase inhibitors / I. Tegeder, J. Pfeilschifter, G. Geisslinger // The FASEB Journal. - 2001. - N 15. - P 2057-2072.

16. Van den Berg J. M. Divergent effects of tumor necrosis factor- on apoptosis of human neutrophils / J. M. Van den Berg, S. Weyer, J. J. Weening et al. // Journal of Leukocyte Biology. - 2001. - N 69. - P 467-473.

APOPTOSIS: CONCEPT, MECHANISMS OF REALIZATION, SIGNIFICANCE

О. Yu. Varga, V. А. Ryabkov

State University, Petrozavodsk

In the article, the concept of apoptosis, a coded cell death, has been given, the present-day notions about mechanisms of its realization - the ways of «death receptors» typical for physiological processes, and the mitochondrial way of apoptosis activation typical for pathologic processes, main participants, role of endoplasmic reticulum, significance of apoptosis in biology and medicine have been shown.

Key words: apoptosis, coded cell death, cytokines, way of «death receptors», mitochondrial way.

Процесс, при котором клетка может убивать сама себя, называется запрограммированной клеточной гибелью (ЗГК). Этот механизм имеет несколько разновидностей и играет важнейшую роль в физиологии различных организмов, особенно многоклеточных. Самой часто встречающейся и хорошо изученной формой ЗГК является апоптоз.

Что такое апоптоз

Апоптоз - это контролируемый физиологический процесс самоуничтожения клетки, характеризующийся поэтапным разрушением и фрагментацией ее содержимого с формированием мембранных пузырьков (апоптозных телец), впоследствии поглощаемых фагоцитами. Этот генетически заложенный механизм активируется под воздействием определенных внутренних или внешних факторов.

При таком варианте гибели клеточное содержимое не выходит за пределы мембраны и не вызывает воспаление. Нарушения в регуляции апоптоза приводят к серьезным патологиям, таким как неконтролируемые клеточные деления или дегенерация тканей.

Апоптоз представляет собой лишь одну из нескольких форм запрограммированной гибели клетки (ЗГК), поэтому отождествлять эти понятия ошибочно. К известным видам клеточного самоуничтожения относят также митотическую катастрофу, аутофагию и программированный некроз. Другие механизмы ЗГК пока не изучены.

Причины апоптоза клеток

Причиной запуска механизма запрограммированной клеточной гибели могут быть как естественные физиологические процессы, так и патологические изменения, вызванные внутренними дефектами или воздействием внешних неблагоприятных факторов.

В норме апоптоз уравновешивает процесс деления клеток, регулируя их количество и способствуя обновлению тканей. В таком случае причиной ЗГК служат определенные сигналы, входящие в систему контроля гомеостаза. С помощью апоптоза уничтожаются одноразовые или выполнившие свою функцию клетки. Так, повышенное содержание лейкоцитов, нейтрофилов и других элементов клеточного иммунитета по окончании борьбы с инфекцией устраняется именно за счет апоптоза.

Запрограммированная гибель является частью физиологического цикла репродуктивных систем. Апоптоз задействован в процессе оогенеза, а также способствует гибели яйцеклетки при отсутствии оплодотворения.

Классическим примером участия апоптоза клеток в жизненном цикле вегетативных систем является осенний листопад. Сам термин происходит от греческого слова apoptosis, что буквально переводится как "опадание".

Апоптоз играет важнейшую роль в эмбриогенезе и онтогенезе, когда в организме сменяются ткани и атрофируются определенные органы. Примером могут служить исчезновение перепонок между пальцами конечностей некоторых млекопитающих или отмирание хвоста при метаморфозе лягушки.

Апоптоз может быть спровоцирован накоплением дефектных изменений в клетке, возникших в результате мутаций, старения или ошибок митоза. Причиной запуска ЗГК могут быть неблагоприятная среда (недостаток питательных компонентов, дефицит кислорода) и патологические внешние воздействия, опосредованные вирусами, бактериями, токсинами и т. д. При этом если повреждающий эффект слишком интенсивен, то клетка не успевает осуществить механизм апоптоза и погибает в результате развития патологического процесса - некроза.

Морфологические и структурно-биохимические изменения клетки во время апоптоза

Процесс апоптоза характеризуется определенным набором морфологических изменений, которые с помощью микроскопии можно наблюдать в препарате ткани in vitro.

К основным признакам, характерным для апоптоза клеток, относят:

• перестраивание цитоскелета;
• уплотнение клеточного содержимого;
• конденсацию хроматина;
• фрагментацию ядра;
• уменьшение объема клетки;
• сморщивание контура мембраны;
• образование пузырьков на клеточной поверхности,
• деструкцию органоидов.

У животных эти процессы завершаются образованием апоптоцитов, которые могут быть поглощены как макрофагами, так и соседними клетками ткани. У растений формирования апоптозных телец не происходит, а после деградации протопласта сохраняется остов в виде клеточной стенки.

Помимо морфологических изменений, апоптоз сопровождается рядом перестроек на молекулярном уровне. Происходит повышение липазной и нуклеазной активностей, которые влекут за собой фрагментацию хроматина и многих белков. Резко увеличивается содержание сАМФ, изменяется структура клеточной мембраны. В растительных клетках наблюдается образование гигантских вакуолей.

Чем апоптоз отличается от некроза

Главное различие между апоптозом и некрозом заключается в причине клеточной деградации. В первом случае источником разрушения служат молекулярные инструменты самой клетки, которые работают под строгим контролем и требуют затрат энергии АТФ. При некрозе происходит пассивное прекращение жизнедеятельности из-за внешнего повреждающего воздействия.

Апоптоз - это естественный физиологический процесс, сконструированный таким образом, чтобы не вредить окружающим клеткам. Некроз - это неконтролируемое патологическое явление, возникающее в результате критических повреждений. Поэтому неудивительно, что механизм, морфология и последствия апоптоза и некроза во многом противоположны. Однако имеются и общие черты.

В случае повреждения клетки запускают механизм запрограммированной гибели в том числе для того, чтобы не допустить некротического развития. Однако недавние исследования показали, что существует иная непатологическая форма некроза, которую также отнесли к ЗГК.

Биологическое значение апоптоза

Несмотря на то что апоптоз приводит к клеточной гибели, его роль для поддержания нормальной жизнедеятельности всего организма очень велика. Благодаря механизму ЗГК осуществляются следующие физиологические функции:

• поддержание баланса между пролиферацией и смертью клеток;
• обновление тканей и органов;
• устранение дефектных и "старых" клеток;
• защита от развития патогенного некроза;
• смена тканей и органов при эмбрио- и онтогенезе;
• удаление ненужных элементов, выполнивших свою функцию;
• устранение клеток, нежелательных или опасных для организма (мутантных, опухолевых, зараженных вирусом);
• предотвращение развития инфекции.

Таким образом, апоптоз является одним из способов поддержания клеточно-тканевого гомеостаза.

Этапы клеточной смерти

То, что происходит с клеткой при апоптозе, является результатом сложной цепочки молекулярных взаимодействий между различными ферментами. Реакции проходят по типу каскада, когда одни белки активируют другие, способствуя постепенному развитию сценария гибели. Этот процесс можно разделить на несколько этапов:

1. Индукция.
2. Активация проапоптических белков.
3. Активация каспаз.
4. Разрушение и перестройка клеточных органелл.
5. Формирование апоптоцитов.
6. Подготовка клеточных фрагментов к фагоцитозу.

Синтез всех компонентов, необходимых для запуска, реализации и контроля каждого этапа заложен генетически, почему апоптоз и называют запрограммированной гибелью клетки. Активация этого процесса находится под строгим контролем регуляторных систем, включающих в том числе и различные ингибиторы ЗГК.

Молекулярные механизмы апоптоза клетки

Развитие апоптоза обуславливается совокупным действием двух молекулярных систем: индукционной и эффекторной. Первый блок отвечает за контролируемый запуск ЗГК. В него входят так называемые рецепторы смерти, Cys-Asp-протеазы (каспазы), ряд митохондриальных компонентов и проапоптических белков. Все элементы индукционной фазы можно разделить на тригеры (участвуют в индукции) и модуляторы, обеспечивающие трансдукцию сигнала смерти.

Эффекторную систему составляют молекулярные инструменты, обеспечивающие деградацию и перестройку клеточных компонентов. Переход между первой и второй фазами осуществляется на этапе протеолитического каспазного каскада. Именно за счет компонентов эффекторного блока происходит гибель клетки при апоптозе.

Факторы апоптоза

Структурно-морфологические и биохимические изменения при апоптозе осуществляются определенным набором специализированных клеточных инструментов, среди которых наиболее важными являются каспасы, нуклеазы и мембранные модификаторы.

Каспазы - группа ферментов, разрезающих пептидные связи по остаткам аспарагина, фрагментируя белки на крупные пептиды. До начала апоптоза присутствуют в клетке в неактивном состоянии из-за ингибиторов. Главной мишенью каспаз являются ядерные белки.

Нуклеазы - ответственны за разрезание молекул ДНК. Особо важна в развитии апоптоза активная эндонуклеаза CAD, разрывающая участки хроматина в областях линкерных последовательностей. В результате образуются фрагменты длиной 120-180 нуклеотидных пар. Комплексное воздействие протеолитических каспаз и нуклеаз приводит к деформации и фрагментации ядра.

Модификаторы клеточной мембраны - нарушают асимметричность билипидного слоя, превращая его в мишень для фагоцитирующих клеток.

Ключевая роль в развитии апоптоза принадлежит каспазам, которые поэтапно активируют все последующие механизмы деградации и морфологической перестройки.

Роль каспаз в клеточной гибели

Семейство каспаз включает 14 белков. Часть из них не задействована в апоптозе, а остальные подразделяются на 2 группы: инициаторные (2, 8, 9, 10, 12) и эффекторные (3, 6 и 7), которые иначе называются каспазами второго эшелона. Все эти белки синтезируются в виде предшественников - прокаспаз, активируемых протеолитическим расщеплением, суть которого состоит в отсоединении N-концевого домена и разделении оставшейся молекулы на две части, в последствии ассоциирующиеся в димеры и тетрамеры.

Инициаторные каспазы необходимы для активации эффекторной группы, которая проявляет протеолитическую активность в отношении различных жизненно важных клеточных белков. К субстратам каспаз второго эшелона относятся:

• ферменты репарации ДНК;
• игибитор белка р-53;
• поли-(ADP-рибозо)-полимераза;
• ингибитор ДНК-азы DFF (разрушение этого белка приводит к активации эндонуклеазы CAD) и др.

Общее количество мишеней эффекторных каспаз насчитывает более 60 белков.

Ингибирование апоптоза клеток еще возможно на стадии активации инициаторных прокаспаз. Когда эффекторные каспазы вступают в действие, процесс становится необратимым.

Пути активации апоптоза

Передача сигнала для запуска апоптоза клетки может быть осуществлена двумя путями: рецепторным (или внешним) и митохондриальным. В первом случае процесс активируется через специфические рецепторы смерти, воспринимающие внешние сигналы, которыми служат белки семейства TNF или Fas-лиганды, расположенные на поверхности Т-киллеров.

В состав рецептора входит 2 функциональных домена: трансмембранный (предназначенный для связи с лигандом) и ориентированный внутрь клетки "домен смерти", индуцирующий апоптоз. Механизм рецепторного пути основывается на образовании DISC-комплекса, активирующего инициаторные каспазы 8 или 10.

Сборка начинается со взаимодействия домена смерти с внутриклеточными адапторными белками, которые, в свою очередь, связывают инициаторные прокаспазы. В составе комплекса последние превращаются в функционально-активные каспазы и запускают дальнейший апоптозный каскад.

Механизм внутреннего пути основан на активации протеолитического каскада особыми митохондриальными белками, выброс которых контролируется внутриклеточными сигналами. Выход компонентов органоидов осуществляется через образование огромных пор.

Особая роль в запуске принадлежит цитохрому с. Попадая в цитоплазму, этот компонент электротранспортной цепи связывается с белком Apaf1 (апоптотический фактор активации протеаз), что приводит к активации последнего. Затем Apaf1 связывают инициаторные прокаспазы 9, которые по механизму каскада запускают апоптоз.

Контроль внутреннего пути осуществляется особой группой белков семейства Bcl12, которые регулируют выход межмембранных компонентов митохондрий в цитоплазму. В составе семейства имеются как проапоптические, так и антиапоптические белки, баланс между которыми и определяет, будет ли запущен процесс.

К одним из мощных факторов, запускающих апоптоз по митохондриальному механизму, относятся реактивные формы кислорода. Еще одним значимым индуктором является белок р53, который активирует митохондриальный путь при наличии ДНК-повреждений.

Иногда запуск апоптоза клеток сочетает в себе сразу два пути: как внешний, так и внутренний. Последний обычно служит для усиления рецепторной активации.

1) Рецепторный. Осуществляется с помощью «рецепторов смерти» при активирующем взаимодействии с соответствующими лигандами, большинство из которых относится к суперсемейству фактора некроза опухолей. Взаимодействие рецептора с лигандом приводит к активации адапторных белков, ассоциированных с «доменами смерти» (FADD - Fas-associated death domain, TRADD - TNF-R-associated death domain), и прокаспазы 8, продукт которой - каспаза 8 (инициаторная) активирует каспазу 3 (эффекторную), что, в свою очередь, обусловливает активацию эндонуклеаз, фрагментирующих ДНК.

2) Митохондриальный. Участие митохондрий в апоптозе обеспечивается присутствием в их матриксе и межмембранном пространстве большого количества биологически активных веществ (цитохрома С (Cyt С); прокаспаз 2, 3, 9; апоптозиндуцирующего фактора (AIF), обладающих выраженным апоптогенным действием. Фактором активации апоптоза является выход данных веществ в цитоплазму при снижении трансмембранного потенциала митохондрий вследствие открытия гигантских митохондриальных пор (выполняют роль Ca 2 +-, рН-, потенциал-, НАДФ2Н/НАДФ+- и редоксзависимых каналов) и повышения проницаемости митохондриальных мембран. К раскрытию пор приводят истощение в клетках восстановленного глутатиона, НАДФН, АТФ и АДФ, образование активных форм кислорода, разобщение окислительного фосфорилирования, увеличение содержания Ca 2 + в цитоплазме. Поступление межмембранных белков и активация апоптоза возможны также при разрыве наружной мембраны митохондрий вследствие гиперполяризации внутренней мембраны.

3) р53-опосредованный. p53 - многофункциональный белок, играющий важную роль в мониторинге сигналов о состоянии клетки, целостности ее генома, активности систем ДНК-репарации. Повреждение ДНК ведет к накоплению белка р53 в клетке. Это определяет остановку клеточного цикла в фазах G 1 и G 2 , предотвращает репликацию, активирует синтез и репарацию ДНК, а следовательно, создает условия для восстановления нативной структуры ДНК, препятствует появлению мутантных и анеуплоидных клеток в организме. В случае если имеется недостаточность систем ДНК-репарации и повреждения ДНК сохраняются, клетка подвергается апоптозу. В частности, белок р53 способен индуцировать транскрипцию таких апоптогенных факторов, как Bax, Fas- рецептор, DR-5 и др.

4) Перфорин-гранзимовый. Цитотоксические Т-лимфоциты (Т-киллеры) вызывают апоптоз клеток-мишеней (например, инфицированных клеток) с помощью белка перфорина. Полимеризуясь, перфорин образует в цитоплазматической мембране клеткимишени трансмембранные каналы, по которым внутрь клетки поступают секретируемые Т-киллером гранзимы (фрагментины) - смесь сериновых протеаз. Основным компонентом этой смеси является гранзим В - протеолитический фермент, активирующий каспазу 3.

Значение белков-регуляторов апоптоза в развитии организма и патологических процессах

Вcl-2 требуется для поддержания жизнеспособности лимфоцитов, меланоцитов, эпителия кишечника и клеток почек во время развития эмбриона.

Вcl-x необходим для ингибирования смерти клеток в эмбриогенезе, особенно в нервной системе.

Bax необходим для апоптоза тимоцитов и поддержания жизнеспособности сперматозоидов во время их развития.

р53 является геном супрессии опухолей, поэтому в эмбриогенезе особой роли не играет, но обязательно необходим для супрессии опухолевого роста.

Усиленный синтез белка, кодируемого bcl-2 геном, приводит к подавлению апоптоза и, соответственно, развитию опухолей; данный феномен обнаружен в клетках В-клеточной фолликулярной лимфомы.

При лимфопролиферативных заболеваниях и похожей на системную красную волчанку болезни у мышей наблюдается нарушение функции Fas-лиганда или Fas-рецептора.

Повышенный синтез Fas-лиганда предупреждает отторжение трансплантата.

Апоптоз является частью патологического процесса при инфицировании клетки аденовирусами, бакуловирусами, ВИЧ и вирусами гриппа.

Ингибирование апоптоза в клетке-хозяине наблюдается при персистировании инфекции, в латентном периоде, а при усиленной репликации аденовирусов, бакуловирусов, возможно герпесвирусов, вируса Эпштейн-Барра и ВИЧ наблюдается активация апоптоза в клетках иммунной системы, что способствует распространению вируса.

» был впервые применен в 1972 г. Kerr, Wyllie et Currie для описания особой морфологической формы генетически запрограммированной гибели клеток, отличающейся от некроза.

Апоптоз является гомеостатическим механизмом, поддерживающим постоянство клеточной популяции в тканях, а также защитным механизмом при иммунных реакциях или при повреждении клеток при заболеваниях и при воздействии инфекционных агентов.

Апоптоз обусловлен процессами, которые вызывают активацию группы цистеиновых протеаз, называемых «каспазы», каскадный комплекс которых обуславливает в конечном итоге гибель клеток.

Поскольку клетки при апоптозе не освобождают свое содержимое в окружающие ткани и быстро фагоцитируются макрофагами, воспалительная реакция обычно отсутствует. Следует отметить, что пикноз и кариорексис не являются исключительным признаком апоптоза и могут быть частью цитоморфологического спектра при некрозе.

Ионизирующее излучение , химиопрепараты приводят к повреждению ДНК в клетках, что вызывает их гибель посредством в53-зависимого пути. Воздействие воспалительных агентов в малых дозах (гипоксия, радиация, повышение температуры) индуцирует апоптоз, вызывая некроз при воздействии в больших дозах.

При некрозе потеря клеточной мембраны приводит к освобождению цитоплазматического содержимого в окружающие ткани, посылая сигналы хемотаксиса, приводящего к клеточному воспалению. Хемотаксические факторы подразделяются на две категории: короткого и дальнего действия, формирующие навигационные сигналы в локальной области тканей, приводящие к миграции макрофагов из циркуляции.

Кроме того, радикально изменяется плазматическая мембрана апоптотических клеток: изменяется ее проницаемость, топология липидов с потерей фосфолипидной асимметрии, окисления и восстановления анионных фосфолипидов, фосфатидилсеринов с выходом их из клетки.

Изменяется также расположение углеводов на мембране, и различные белки (включая кальретикулин, аннексин 1), большие субъединицы инициирующего трансляцию фактора 3, ДНК, переносятся к поверхности апоптотических клеток и взаимодействуют (прямо или косвенно) с фагоцитами.

Такое изменение расположения макромолекул на поверхности апоптотических клеток является ключевым моментом во взаимодействии с фагоцитами. В процессе апоптоза происходит также потеря ингибиторных молекул (CD31 и CD47) с поверхности клеток (механизм «не ешь меня») с последующим взаимодействием апоптотических клеток с фагоцитами. Ниже схематически представлено большинство молекул, вовлеченных во взаимодействие между фагоцитами и апоптотичес-кими клетками (рис. 6).

Рис. 6. Молекулы, вовлеченные во взаимодействие между фагоцитами и апоптотическими клетками

Примечание: ABCA, АТФ-связывающиий кассетный транспортер A1; ACAMPs, апоптотические клеточно-связанные молекулярные партнеры; ASGP-R, рецептор асиалогликопротеина; 2GPI, 2 гликопротеин1; 2GPI-R, 2GPI-рецептор; интегрины, включая CR3 иCR4 ; BAI1, ангиогенный мозгово-специфический ингибитор; C1q, первый компонент комплемента; CHO, карбогидраты; CRP, С-реактивный белок; CRT, кальретикулин; CH3CR1, рецептор фракталькина; Del-1, эндотелиальный развивающий локус-1; FKN, фракталькин; GA, G-протеин-связанный LPC рецептор; Gas-6, фактор остановки роста-6; iC3b, инактивирующий комплемент фрагмент C3b; ICAM-3 (CD50), молекула-3 внутриклеточной адгезии; Lox-1, рецептор окисленного липопротеина низкой плотности; LPC, лизофосфатидил холин; MER, миелоидная эпителиальная репродуктивная тирозин киназа; MFG-E8, глобулин молочного жира эпидермального ростового фактора-8; Ox-PL, окисленный фосфолипид; P2Y2, G-протеин-связанный ядерный рецептор; PE, фосфатидилэтаноламин; PS, фосфатидилсерин; SAP, сывороточный амилоидный протеин; SHPS-1, гомолог2 доменсодержащего протеина субстрата-1 тирозин киназы; SR-AI, удаляющий рецептор (мусорщик) AI; SR-BI, удаляющий рецептор BI; TIM-1/4, молекулы Т-клеточного иммуноглобулина и муцин-содержащего домена; TSP-1, тромбоспондин-1.

Изменения клеток при апоптозе

Сжатие клетки. Клетка уменьшается в размерах, цитоплазма уплотняется; органеллы, которые выглядят нормальными, располагаются более компактно. Предполагается, что нарушение формы и объема клетки происходит в результате активации в апоптотических клетках трансглютаминазы.

Этот фермент вызывает прогрессивное образование перекрестных связей в цитоплазматических белках, что приводит к формированию своеобразной оболочки под клеточной мембраной.

Конденсация хроматина

Ядро может разрываться на несколько фрагментов. Конденсация хроматина обусловлена расщеплением ядерной ДНК в местах, связывающих отдельные нуклеосомы, что приводит к образованию большого количества фрагментов, в которых число пар оснований составляет 180-200.

При электрофорезе фрагменты дают характерную картину лестницы (клеваж ДНК). Фрагментация ДНК в нуклеосомах происходит под действием кальций чувствительной эндонуклеазы.

Эндонуклеаза в некоторых клетках находится постоянно; в тимоцитах она активируется появлением в цитоплазме свободного кальция, а в других клетках синтезируется перед началом апоптоза.

Формирование апоптотических телец

Апоптотические тельца быстро разрушаются в лизосомах макрофагов, а окружающие клетки либо мигрируют, либо делятся, чтобы заполнить освободившееся после гибели клетки пространство. Фагоцитоз апоптотических телец макрофагами или другими клетками активируется рецепторами на данных клетках: они захватывают и поглощают эти тельца.

В табл. 5 приводятся сравнительные данные по морфологическим изменениям при апоптозе и некрозе

Таблица 5. Морфологические изменения при апоптозе и некрозе

Геном человека содержит около 13 каспаз, их количество зависит от генетического полиморфизма. Каспазы присутствуют в цитоплазме в виде проэнзимов и активируются до полностью функциональных протеаз путем расщепления энзима на малую и большую субъединицы и дальнейшего отщепления от их N-концевых доменов.

Затем субъединицы собираются в тетрамер с двумя активными центрами. Расщепление прокаспаз могут осуществлять различные протеазы, в том числе и другие каспазы. По выполняемой каспазами функции их разделяют на две группы: инициаторные каспазы (8, 9 и 10) и эффекторные каспазы (3, 6, и 7). После того, как каспазы из первой группы активируют эффекторные каспазы, процесс апоптоза оказывается необратимым.

Расщепление каспазами ряда ключевых субстратов приводит к фрагментации ДНК и деструкции клетки. Для активации каспаз существует несколько путей, два из которых наиболее изучены и привлекают большое внимание в последнее время. Эти два пути апоптоза обычно обозначаются как внешний и внутренний путь.

Ниже представлено схематическое изображение разных путей апоптоза

Рис. 7. Схемы внешнего и внутреннего путей апоптоза, а также перфорин/гранзимного пути, который действует по каспазонезависимому пути. Результаты всех путей приводят к цитоморфологическим изменениям, включая сморщивание клеток, конденсацию хроматина, образование цитоплазматических и апоптотических телец, что в итоге приводит к фагоцитозу апоптотических телец

Внутренний путь апоптоза (intrisic pathway)

Негативные сигналы включают отсутствие факторов роста, гормонов и цитокинов, что ведет к нарушениям супрессии программы клеточной смерти, активируя апоптоз. Другие положительные стимулы включают радиацию, токсины, гипоксию, гипертермию, вирусные инфекции и свободные радикалы.

Все эти стимулы вызывают изменения внутренней мембраны митохондрий, результатом чего является открытие пор митохондриальной проницаемости, потеря митохондриального мембранного потенциала и освобождение двух наиболее больших групп проапоптотических протеинов. В митохондрии сходятся многие сигналы, вызывающие повреждение ДНК, нарушения микротрубочек, факторов роста, что вызывает освобождение из этих органелл в цитозол цитохрома с и других апоптогенных белков.

В цитозоле цитохром с связывается с белком, активирующим каспазы, апоптотическим протеазе -активирующим фактором 1 (Apafl). Apafl играет роль арматуры, на которой происходит аутокаталитический процессинг каспазы-9. В результате зависимого от гидролиза аденозинтрифосфата (АТФ) конформационного изменения Apaf1 приобретает способность связывать цитохром с.

Связав цитохром с, Apafl претерпевает дальнейшее конформационное изменение, способствующее его олигомеризации в гептаметрический комплекс и открывающее доступ каспазоизменяющего домена (CARD) Apafl для прокаспазы-9, которая также содержит CARD-домен.

В результате формируется мультипротеиновая структура, известная как «апоптосома». Связь Apafl с прокаспазой-9 обусловлена CARDs посредством гомотипического соединения (CARD-CARD). Активация апоптосомо-ассоциированной протеазы каспазы-9 инициирует протеолитический каскад, который активирует клеваж каспазы-9 и активирует прокаспазу-3.

Другая группа проапоптотических протеинов, апоптоз-индуцирующих факторов (AIF), эндонуклеазы G и CAD (каспазоактивируемая ДНКаза), освобождаются из митохондрий в процессе апоптоза. AIF фрагментирует ДНК и обуславливает конденсацию периферического ядерного хроматина.

Эндонуклеаза G перемещается в ядро, где расщепляет ядерный хроматин, образуя фрагменты олигонуклеосомальной ДНК. AIF и эндонуклеаза G действуют по каспазонезависимому пути. CAD последовательно освобождается из митохондрий и перемещается в ядро, где приводит к фрагментации олигонуклеосомальной ДНК и распространенной конденсации хроматина.

Контроль и регулирование данного митохондриального пути осуществляется белками семейства Bcl-2. Протеин гена-супрессора р53 играет критическую роль в регуляции белков семейства Bcl-2. Семейство белков Bcl-2 контролирует проницаемость митохондриальной мембраны и может действовать проапоптотически или антиапоптотически. Хотя геном человека содержит 25 членов этого семейства, только 6 из них являются антиапоптотическими.

Семейство белков Bcl-2 можно разделить на три основные группы:

1. Антиапоптогенные молекулы, такие как Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, Bcl-W, Bfl-1, Bcl-B. Все они обладают антиапоптозной активностью, имеют четыре группы гомологичных последовательностей - ВН1, ВН2, ВН3 и ВН4 домены, хотя у некоторых из них домен ВН4 отсутствует. Эти молекулы представляют мембранные белки, находящиеся в митохондрии, эндоплазматическом ретикулуме и в ядерной мембране.
2. Проапоптогенные молекулы Bax, Bad, Bak, Mtd(Bok) и Diva имеют гомологичные последовательности ВН1, ВН2 и ВН3, а ВН4 домен у них отсутствует.
3. Проапоптогенные белки, содержащие только ВН3 домен: Bik, Bid, Bim, Hrk (DR5), Blk, Bnip3, Bnip3L.

Они в основном локализованы в цитозоле или связаны с цитоскелетом.
ВН1 -3 домены играют важную роль в формировании гетеро-и гомодимеров между проапоптогенными и антиапоптогенными членами семейства, и клеточные уровни этих димеров играют определяющую роль в судьбе клетки.

Гетеродимеризация происходит путем взаимодействия ВН3 домена проапоптогенного белка с гидрофобным комплексом, образованным ВН1, ВН2 и ВН3 доменами антиапоптогенных белков.
Домены ВН1, ВН2 и ВН4 необходимы для антиапоптогенной активности белка, в то время как ВН3 домен необходим для протоапоптогенной активности.

Функция белка Bcl-2 может быть дополнена возможностью посттрансляционной модификации с помощью фосфорилирования. Близкий ген, Bcl-x кодирует два белка, различающихся сплайсингом РНК, Bcl-xL и Bcl-xS. Так же как Bcl-2, белок Bcl-xL ингибирует апоптоз, в то время как белок Bcl-xS оказывает негативный эффект на функцию Bcl-2 и Bcl-xL.

Повышенная экспрессия генов этих белков может приводить к устойчивости к большинству вызывающих апоптоз стимулов, так как к этим белкам сходится множество путей апоптоза. Гиперэкспрессия некоторых антиапоптотических протеинов доказана при различных гематологических новообразованиях. Например, повышение уровня белка Bcl-2 в результате t(14; 18), вовлекающей ген BCL2, наблюдается в 80-90% случаев фолликулярной неходжкинской лимфомы.

Рис. 8. Схема апоптоза с участием всех ключевых факторов

Примерно 1/3 пациентов с диффузной В-крупноклеточной лимфомой имеют патологическое повышение уровня Bcl-2 (часто в ассоциации с t(14;18) или амплификацией гена), что коррелирует со снижением продолжительности жизни, несмотря на проведение комбинированной химиотерапии с включением ритуксимаба (анти-CD20 антител).

Большинство пациентов с ХЛЛ содержат повышенный уровень Bcl-2, ассоциированный с гипометилированием гена BCL2. В противоположность генетическим изменениям, активирующим антиапоптотические гены BCL2 и MCL1, при лейкозах и лимфомах с нестабильными микросателлитами часто происходят мутации, инактивирующие проапоптотический ген BAX.

Баланс между проапоптотическими и антиапоптотическими регуляторами апоптоза является основным механизмом, обеспечивая выживаемость длительно живущих клеток и замену ими короткоживущих клеток в различных тканях, включая костный мозг, тимус и периферические лимфоидные ткани. Дисбаланс этих протеинов в конечном итоге приводит к избирательным преимуществам в выживании клеток, что приводит к развитию новообразований.

Номенклатура основных белков внутреннего пути апоптоза приведена в табл. 6.

Таблица 6. Номенклатура основных белков внутреннего пути апоптоза

Внешний путь апоптоза (extrinsic pathway)

Семейство цитокинов ФНО состоит у человека из 18 членов. Некоторые из рецепторов семейства ФНО передают сигналы преимущественно для выживания клеток путем связывания внутриклеточного опухолевого рецептор-ассоциированного фактора (TRAF), семейства адаптерных белков. Блокирование этих рецепторов представляет новую стратегию в терапии лимфоидных опухолей. Другие члены семейства ФНО напрямую включают апопотоз, в частности, те, которые содержат «домен смерти» в их цитозольной части.

Стратегия для применения вызывающих апоптоз лиганд семейства ФНО включает: рекомбинантные лиганды, экспрессируемые только экстрацеллюлярной частью мембранных протеинов; моноклональные антитела, которые связывают рецепторы и включают апоптоз.

Подгруппа рецепторов семейства ФНО имеет цитоплазматический домен, состоящий из 80 аминокислот, именуемый «домен смерти» (DD), который при внутриклеточном взаимодействии с белками-адаптерами привязывает эти рецепторы к специфическим каспазам. Домен смерти играет основную роль в передаче сигнала смерти с поверхности клетки по внутриклеточному пути.

Связавшись с лигандом, рецепторы семейства ФНО образуют кластеры цитозольного DD на мембране, изменяя каспазосвязанный адаптерный протеин. Образующееся соединение адаптерного Fas-ассоциированного протеина с доменом смерти (FADD) состоит из DD и содержащего эффектор домена смерти (DED). DED в составе FADD связывает DED-содержащие прокаспазы (в частности, каспазы 8 и 10), формируя «смерть-индуцирующий сигнальный комплекс» (DISC), в результате чего происходит активация каспаз.

После активации каспазы-8 включается заключительная фаза апоптоза. Апоптоз, обусловленный рецептором смерти, может ингибироваться протеином c-FLIP (протеин, ингибирующий FLICE), который связывается с FADD и каспазой-8, делая их неэффективными.

Ниже представлена схема пути активации каспаз.

Рис. 9. Пути активации каспаз

Наличие дополнительных путей апоптоза включает:

1) путь апоптоза, индуцированный цитотоксическими лимфоцитами (CTL) и натуральными киллерами (NK), при котором сериновая протеаза гранзим В проникает внутрь клетки;
2) путь стресса эндоплазматического ретикулума (ER) с вовлечением каспазы-12;
3) р53-индуцированный путь, опосредoванный р53-индуцированным доменом смерти (PIDD), который связывает адапторный протеин ICH-1/протеин-3 (CED-3) домена смерти с доменом смерти, как активатором каспазы-2.

Номенклатура основных белков внешнего пути апоптоза приведена в табл. 7.

Таблица 7. Номенклатура основных белков внешнего пути апоптоза

Перфорин-гранзимный путь апоптоза (perforin-granzime pathway)

Полимеризуясь, перфорин образует в цитоплазматической мембране клетки-мишени трансмембранные каналы с последующим проникновением в клетки ФНО-в и гранзимов А и В - смеси сериновых протеаз. Гранзим В активирует прокаспазу-10 и может расщеплять ингибитор каспазактивируемой ДНКазы, а также использовать митохондриальный путь для амплификации сигнала смерти и вызывать освобождение цитохрома с.

Кроме того, гранзим В может напрямую активизировать каспазу-3, что может индуцировать заключительную фазу апоптоза. Таким образом, митохондриаль-ный путь и прямая активация каспазы-3 являются основными путями индуцированного гранзимом В уничтожения клеток.

Гранзим А также вызывает апоптоз, активируя каспазонезависимый путь апоптоза. Он расщепляет посредством активации ДНКазы продукт гена тумор-супрессора, вызывая апоптоз опухолевых клеток. Инактивация этого белка ведет к апоптозу вследствие блокирования восстановления ДНК и структуры хроматина.

Внешний и внутренний пути апоптоза заканчиваются в экзекутивной (исполнительной) фазе. Эта фаза начинается с активации экзекутивных («казнящих») каспаз, которые активируют цитоплазматические эндонуклеазы с деградацией ядерного материала, и активируют протеазы с последующей деградацией ядерных протеинов и протеинов цитоскелета. Каспаза-3 является наиболее важной экзекутивной каспазой и может активироваться любой каспазой (каспаза-8, каспаза-9 или каспаза-10).

Номенклатура основных белков экзекутивного пути апоптоза представлена в табл. 8.

Таблица 8. Номенклатура основных белков экзекутивного пути апоптоза

Е.В. Зуховицкая, А.Т. Фиясь